系統(tǒng)生物學方法在骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)證候研究中的應用?

章軼立，齊保玉，魏 戌△，戴建業(yè)，王 旭，申 浩，謝雁鳴

(1. 中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102； 2. 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029； 3.蘭州大學藥學院，蘭州 730020； 4. 北京市豐臺區(qū)長辛店社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京 100072； 5.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)主要表現(xiàn)為骨代謝異常，以全身性骨痛和易發(fā)生脆性骨折為特征性表現(xiàn)，與增齡關系密切，發(fā)病率呈逐年遞增趨勢[1]。中醫(yī)藥在提高OP患者骨密度、改善臨床癥狀、促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合等方面具有一定的優(yōu)勢[2-3]。證候作為中醫(yī)臨床診治的重要依據(jù)，是中醫(yī)學研究中的核心要素與學理支點[4]。系統(tǒng)生物學是研究生物系統(tǒng)中所有組分(如基因、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等)構(gòu)成，以及在特定條件下(如遺傳、環(huán)境變化等)各組分之間相互關系的學科，以多種組學技術為代表，為闡釋中醫(yī)證候生物學基礎與辨證論治的科學內(nèi)涵提供了重要的方法學支撐[5-7]?，F(xiàn)就近年來系統(tǒng)生物學方法在OP中醫(yī)證候研究中的應用進行述評。

1 基因組學研究

基因組學關注微觀的、相對穩(wěn)定的生物基因精確結(jié)構(gòu)、相互關系及表達調(diào)控，強調(diào)基因表達的差異是造成個體差異的主要原因。證候基因組學是在中醫(yī)證候?qū)W理論指導下，運用基因組學的方法探討OP中醫(yī)證候的科學內(nèi)涵，特別是研究同病異證或異病同證時基因的差異表達情況，揭示與證候形成相關的基因及其功能[8-9]。

腎藏精，主骨生髓，腎虛證與OP發(fā)病關系密切。鄭洪新等[10]通過實驗證實，OP腎虛證病理機制與轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、TGFβ誘導早期應答基因1(TGF-β inducible early gene, TIEG1)mRNA等表達異常有關，并運用補腎益髓中藥發(fā)揮對下丘腦-腎-骨反饋機制的調(diào)控作用以預防OP的發(fā)生發(fā)展。尚德陽等[11]發(fā)現(xiàn)，OP的發(fā)生可能與骨、腎、下丘腦組織中Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1, Smurf1)和Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smad ubiquitination regulatory factor 2, Smurf2)的mRNA表達的異常變化有關，補腎中藥可能通過調(diào)控上述因子表達發(fā)揮防治OP的作用。王愛堅等[12]研究提示，載脂蛋白E等位基因ε4頻率升高與絕經(jīng)后婦女腎虛證發(fā)生關系密切，腎虛證與載脂蛋白E基因多態(tài)性存在聯(lián)系。

在絕經(jīng)后OP易感基因與基因多態(tài)性研究方面，國內(nèi)葛繼榮教授團隊前期研究結(jié)果表明，OP證候與遺傳特征可能存在關聯(lián)性，在維生素D受體基因bb型中，絕經(jīng)后OP腎陰陽兩虛證腰椎骨密度明顯低于腎陰虛證患者[13]。另有研究證實[14-15]，絕經(jīng)后OP腎陽虛證與骨鈣素基因多態(tài)性、雌激素受體基因多態(tài)性存在關聯(lián)，而腎陰虛證的發(fā)生與lncRNA uc431+的表達下調(diào)、富亮氨酸2糖蛋白1(leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1, LRG1)的mRNA表達升高有關[16-18]。研究還發(fā)現(xiàn)，LINC00334等8條lncRNAs可能通過調(diào)控Janus激酶/信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)等信號通路參與絕經(jīng)后OP腎陰虛證的發(fā)生發(fā)展過程[19]。此外，李穎等[20]研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后OP中醫(yī)證候與線粒體DNA拷貝數(shù)、DNA氧化損傷的產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷酸含量存在相關性，其中肝腎陰虛證與線粒體DNA拷貝數(shù)相關性高，脾腎陽虛證與8-羥基脫氧鳥苷酸關系密切。李生強等已完成對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證、腎陽虛證骨組織基因表達譜的測定，不同腎虛證候相關基因均與免疫調(diào)節(jié)相關，腎陰虛證基因還與激素合成、組氨酸代謝、礦物質(zhì)吸收等通路相關，而腎陽虛證基因還與TGF-β、細胞周期等信號通路相關[21-22]。

基于現(xiàn)有文獻，目前針對OP證候的基因組學研究主要停留在個別基因?qū)P證候的關聯(lián)，并未從整體的角度探究OP證候發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)問題，未來研究仍需構(gòu)建OP非腎虛證候相關的基因差異表達譜，篩選出與之有關的基因，并從功能基因組學的角度對其調(diào)控網(wǎng)絡進行分析。同時，從“同病異證”和“同證異病”的角度比較基因表達譜的差異，尋找OP證候的同一性和差異性，進而揭示OP證候的科學內(nèi)涵，并為其客觀化診斷提供依據(jù)。

2 蛋白質(zhì)組學研究

蛋白質(zhì)組學是對基因組學的繼承與發(fā)展，可系統(tǒng)分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間存在的相互關系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律[23-24]。證候蛋白質(zhì)組學研究有助于獲得疾病證候的生物學實質(zhì)與生物標志物，進一步使證候研究走向客觀化與標準化[25]。

國內(nèi)學者已初步發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后OP腎陽虛證與LTBP1蛋白表達下調(diào)相關聯(lián)，而腎陰虛證與CLCFI蛋白下調(diào)存在關聯(lián)[26-28]。王蕾等[29]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞相關因子蛋白表達水平與腎陽虛證、脾胃虛弱證、肝腎陰虛證、氣滯血瘀證具有相關性。其中，巨噬細胞集落刺激因子、核因子κB受體活化因子可作為區(qū)別腎陽虛證與其他證候的生物標志物。

鄧洋洋等[30]發(fā)現(xiàn)，腎虛OP模型大鼠Smurf1蛋白在股骨、腎中表達降低，在下丘腦中表達水平升高，而補腎中藥可能通過調(diào)控股骨、腎、下丘腦中Smurf1表達發(fā)揮防治原發(fā)性OP的作用。章建華等[31-32]運用左歸丸與右歸丸含藥血清，對去卵巢大鼠腎陰虛證與腎陽虛證動物模型進行干預，結(jié)果證實兩方均能促進成骨細胞增殖與堿性磷酸酶表達水平，并對細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)與β-catenin的蛋白表達具有一定調(diào)控作用。此外，對比不同動物模型中蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，“左歸丸滋腎陰”作用更強，而“右歸丸溫腎陽”作用更強，與中醫(yī)理論相符。伍超等[33]結(jié)合網(wǎng)絡藥理學與實驗驗證，發(fā)現(xiàn)腎精虧虛證可能與促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)信號通路中低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2, GRB 2)、MAPK3等蛋白密切相關，而補腎益精中藥通過調(diào)控EPO信號通路中靶點蛋白水平的降低，可能是治療腎精虧虛證的作用機制之一。另1項研究表明，電針命門穴可促進骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)及其信號傳導蛋白Smad1/5表達水平，為電針治療絕經(jīng)后OP提供了基礎研究證據(jù)[34]。

與證候基因組學的研究現(xiàn)狀相似，OP證候?qū)用娴牡鞍踪|(zhì)組學研究仍然集中于對療效機制的科學闡釋，多數(shù)聚焦于補腎類中藥可能作用的靶點。而從證候衍變規(guī)律角度出發(fā)，探索證候動態(tài)變化及其生物學內(nèi)涵的相關研究還不夠深入，尚未形成完整的OP證候蛋白質(zhì)組學證據(jù)鏈。

3 代謝組學研究

代謝組學是對生物體內(nèi)的代謝物進行定量分析，試圖尋找代謝物與生理病理變化相對關系的研究，也是系統(tǒng)生物學的重要技術方法之一[35-36]。OP屬于全身代謝性疾病，代謝組學為OP臨床診斷和治療提供了一種整體的方法，對深入理解OP病理機制及中藥等干預機制具有重要作用[37]。證候代謝組學通過測定不同證候間代謝產(chǎn)物的差異，為證候生物學基礎研究開辟了新途徑。

徐琬梨等[38]應用核磁共振氫譜技術測定絕經(jīng)后OP常見實證(腎虛對照組、腎虛血瘀組、腎虛痰濕組、腎虛氣滯組)血清代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明各組間存在差異代謝物，主要生物學功能涉及體內(nèi)能量代謝、氨基酸代謝、蛋白代謝等方面，證實不同中醫(yī)證候與代謝產(chǎn)物密切相關。張波等[39]通過OP腎虛血瘀證與骨質(zhì)疏松癥常規(guī)檢測指標相關性研究證實，OP腎虛血瘀證可能與血清Ⅰ型膠原C末端肽、骨密度、25羥維生素D、雌二醇等具有相關性。帥波等[40]研究證實，骨轉(zhuǎn)換標志物β-骨原交聯(lián)、血清白細胞介素-6、腫瘤壞死因子含量與中醫(yī)“本痿標痹”證候評分存在正相關，建議骨代謝與炎癥指標可作為OP進展評價及療效判定的依據(jù)。

當前多數(shù)研究雖然通過對骨代謝指標相關產(chǎn)物檢測，發(fā)現(xiàn)與OP證候相關的部分代謝指標，但針對骨代謝終端產(chǎn)物的代謝組學研究依然較少。此外，在中醫(yī)藥干預OP的作用機制研究中，雖然應用了代謝組學方法，但因與證候關聯(lián)性較弱，因此未引用相關原始研究文獻。

除應用基因組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學方法研究OP證候外，還有學者運用表觀遺傳學方法研究中醫(yī)證候，主要表觀遺傳機理是miRNA、DNA甲基化，但相關研究仍處于探索階段[41]。

4 討論

隨著生命科學大數(shù)據(jù)時代的到來，組學技術廣泛運用于中醫(yī)中藥研究，各種組學方法已在證候生物學基礎研究方面取得了積極進展[43]。系統(tǒng)生物學因其強調(diào)整體性、時效性的特點與中醫(yī)學整體觀念、辨證論治的思想較為吻合[44]，借助系統(tǒng)生物學的方法與思路，不僅豐富了OP證候的理論內(nèi)涵，拓寬了研究思路，也有助于搭建微觀研究(基因、蛋白、代謝組學研究)與整體研究(證候研究)的橋梁，為OP證候客觀化提供科學依據(jù)[45]。

盡管目前運用系統(tǒng)生物學進行OP證候本質(zhì)研究尚處于探索、發(fā)展階段，但基于系統(tǒng)生物學特點、研究思路、技術方法為OP證候本質(zhì)的研究帶來了新的方向[46-47]。因此，將系統(tǒng)生物學運用于OP證候研究，建立多方向、多層次的組學技術平臺，并通過計算生物學等數(shù)學語言定量描述生物體功能、表型及行為，對揭示OP證候本質(zhì)具有重要意義，進而促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進程。