奶牛無(wú)乳鏈球菌乳房炎研究進(jìn)展

秦平偉，張 艷，黃寶銀，劉雪松，馮萬(wàn)宇，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

奶牛乳房炎是乳腺組織在感染致病性微生物，或受到物理、化學(xué)等因素的刺激后，乳房間質(zhì)或?qū)嵸|(zhì)組織發(fā)生的一種炎性變化。其特征是乳房腫脹，皮膚發(fā)紅，乳房發(fā)熱，疼痛，乳汁變性，患牛產(chǎn)奶量和乳汁品質(zhì)下降，重癥乳房炎患?？梢鹉膛ｓw溫升高，食欲減退或廢絕等全身癥狀，癥狀嚴(yán)重奶牛因產(chǎn)乳量明顯減少或失去泌乳能力而被淘汰，因此，該病具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

引起奶牛乳房炎的常見鏈球菌為無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌，在這三種鏈球菌中無(wú)乳鏈球菌是最常見的病原菌。大量研究結(jié)果表明，奶牛無(wú)乳鏈球菌性乳房炎占奶牛乳房炎發(fā)病率的30%～70%。據(jù)作者統(tǒng)計(jì)2010年以后發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，在分離的奶牛乳房炎病原菌中，無(wú)乳鏈球菌約占分離病原菌的11.04%，乳房鏈球菌的占比率約為8.30%，停乳鏈球菌的占比率約為4.39%，由此可見，無(wú)乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎較常見的病原菌之一。

無(wú)乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎多呈隱型型，相對(duì)臨床型乳房炎而言，隱型乳房炎所造成的經(jīng)濟(jì)損失更大，約占乳房炎總損失的70%～80%,此外，無(wú)乳鏈球菌是一種人獸共患病的典型致病菌之一，該菌可通過(guò)乳腺和牛奶等途徑感染人類，因此，無(wú)乳鏈球菌乳房炎的所造成的危害不可低估，應(yīng)充分引起人們重視。

1 病原及致病特性

無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)屬于B族鏈球菌，革蘭氏染色為陽(yáng)性，細(xì)菌圓形或卵圓形，直徑小于2.0 μm，呈鏈狀排列。依據(jù)無(wú)乳鏈球菌莢膜多糖的差異，該菌分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ共計(jì)10個(gè)血清型。有學(xué)者建立了更為快捷的鑒別方法，Imperi等針對(duì)莢膜多糖相關(guān)基因建立了多重PCR血清型分型鑒定方法，能夠快速精準(zhǔn)鑒定無(wú)乳鏈球菌的血清類型，與傳統(tǒng)的血清學(xué)鑒定方法相較，兩種方法的復(fù)合率高達(dá)100%。

無(wú)乳鏈球菌具有溶血能力，目前，已發(fā)現(xiàn)的無(wú)乳鏈球菌主要致病因子包括：莢膜多糖、溶血素、透明質(zhì)酸酶、環(huán)磷酸腺苷因子、超氧化物歧化酶、絲 。

無(wú)乳鏈球菌多引起奶牛乳房發(fā)生隱型性感染，疾病初期無(wú)乳鏈球菌主要感染乳區(qū)的底部。無(wú)乳鏈球菌感染后可在乳腺細(xì)胞中迅速生長(zhǎng)繁殖，損傷乳腺上皮細(xì)胞、導(dǎo)管及乳腺組織，并導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)組織碎片和白細(xì)胞數(shù)量大量上升，影響乳區(qū)下部的導(dǎo)管系統(tǒng)，引起產(chǎn)奶量下降和乳汁品質(zhì)降低。隨著病情的加重，組織碎片和白細(xì)胞可阻塞乳腺管，導(dǎo)致產(chǎn)奶量急劇降低，體細(xì)胞數(shù)增多。重者可導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管堵塞，引起泌乳組織功能衰退，乳腺組織逐步萎縮，乳房喪失泌乳功能。

2 流行病學(xué)

無(wú)乳鏈球菌是高度傳染性細(xì)菌，且在牛群中傳播速度較快。無(wú)乳鏈球菌曾被認(rèn)為是奶牛乳房?jī)?nèi)專性寄生和嚴(yán)格傳染性病原菌，常存在于奶牛的皮膚、乳頭及乳房?jī)?nèi)。后期研究證實(shí)，在奶牛體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中，如奶牛糞便、水槽、料槽、臥床、擠奶廳等均能分離出無(wú)乳鏈球菌，這說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌在牛場(chǎng)廣泛存在。無(wú)乳鏈球菌屬于接觸性感染菌，感染途徑主要發(fā)生在擠奶過(guò)程中，通過(guò)擠奶員、清洗奶牛乳房的毛巾、用水、擠奶設(shè)備等途徑發(fā)生感染。此外，通過(guò)污染的飼料、飲水等媒介也可感染。

雖然不同地域、不同牛場(chǎng)乳房炎病原菌的發(fā)生區(qū)系及發(fā)生率均有差異，但相似之處是無(wú)乳鏈球菌乳房炎的發(fā)生率均較高。張亞茹等采集甘肅某奶牛場(chǎng)臨床型乳腺炎奶樣，細(xì)菌分離結(jié)果顯示，在125份奶樣中共檢出細(xì)菌128株，病原菌區(qū)系分布主要為大腸桿菌32.03%、無(wú)乳鏈球菌19.53%、腸桿菌10.94%、停乳鏈球菌1.56%。在無(wú)乳鏈球菌中Ⅰa型菌株占72.0%，Ⅱ型菌株28.0%。張哲等采取我國(guó)30多個(gè)城市的120余個(gè)奶牛場(chǎng)的臨床型乳房炎乳樣3 134份，從中分離出致病菌12種共計(jì)2106株，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，無(wú)乳鏈球菌的分離率最高，為38.61%。李新圃等在我國(guó)一些地區(qū)的奶牛場(chǎng)采取乳房炎乳樣，在采集的302份樣品中分離幾率最高的病原菌為無(wú)乳鏈球菌，其在病原菌的占比是27.6%。黃瑛等采集臨床型乳房炎乳樣105份，從中分離出病原菌76株，其中主要為無(wú)乳鏈球菌，占比高達(dá)76.32%。易明梅等采集上海地區(qū)的4個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)乳樣126份，從乳樣中分離出病原菌3種共計(jì)107株，在這些病原菌中無(wú)乳鏈球菌占比為25.23%。2012～2013年李勝利等在采集的894份大罐奶樣中，無(wú)乳鏈球菌的檢出率最高，達(dá)到92.2%。上述結(jié)果表明，無(wú)乳鏈球菌在國(guó)內(nèi)奶牛場(chǎng)的流行廣泛，感染率較高。

在無(wú)乳鏈球菌流行血清型中，我國(guó)流行血清型主要為Ⅰa型和Ⅱ型。杜琳等在華北地區(qū)采集不同區(qū)域奶牛場(chǎng)的乳房炎乳樣，分離鑒定病原離，并對(duì)無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行定型，結(jié)果表明，無(wú)乳鏈球菌主要為Ⅰa型。劉龍海等采集我國(guó)部分地區(qū)奶牛場(chǎng)乳房炎乳樣，從中分離鑒定出無(wú)乳鏈球菌81株，經(jīng)多重PCR對(duì)血清型進(jìn)行鑒定，其中，無(wú)乳鏈球菌Ⅰa型占比為50.62%，無(wú)乳鏈球菌Ⅱ型占比為48.15%。王丹等采集江蘇省部分牛場(chǎng)的乳房炎乳樣，進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，檢驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)乳鏈球菌Ⅱ型是該地區(qū)奶牛場(chǎng)無(wú)乳鏈球菌流行株的優(yōu)勢(shì)血清型。

3 臨床癥狀與病理變化

3.1 臨床癥狀

無(wú)乳鏈球菌可引起奶牛發(fā)生急性、亞急性、慢性和隱型乳房炎。奶牛感染無(wú)乳鏈球菌通常引起多乳區(qū)感染，且引起周期性復(fù)發(fā)的臨床型乳房炎。

輕癥臨床型乳房炎感染奶牛臨床癥狀較為溫和，一般無(wú)全身癥狀，臨床表現(xiàn)為乳汁變稀，感染乳區(qū)產(chǎn)奶量降低，通常下降約40%。有的輕癥慢性感染奶牛乳區(qū)乳汁外觀輕度異常，產(chǎn)奶量持續(xù)低產(chǎn)，長(zhǎng)期感染乳區(qū)外觀有些萎縮。

重癥乳房炎患牛出現(xiàn)全身性臨床癥狀。在感染的初期有些患牛表現(xiàn)間歇性發(fā)熱，外觀乳房腫脹，乳汁變的較稀薄，乳汁中出現(xiàn)塊狀、片狀的乳凝塊，乳汁呈淡紅色血乳，有的奶牛乳房有硬結(jié)。有的感染青年奶牛產(chǎn)頭胎犢時(shí)存在瞎乳區(qū)現(xiàn)象。急性發(fā)病奶牛乳房水腫嚴(yán)重，呈彌漫性水腫，乳汁變質(zhì)，產(chǎn)奶量急劇下降甚至停產(chǎn)。

3.2 病理組織學(xué)變化

患病乳腺小葉增生，有的乳腺實(shí)質(zhì)有直徑0.2～0.5 cm大小的黃色結(jié)節(jié)，并向管腔和乳池內(nèi)腔突出，其中散布著白色薄膜。乳腺出現(xiàn)散發(fā)性或中度炎性浸潤(rùn)，由腺泡和導(dǎo)管內(nèi)的中性粒細(xì)胞，以及間質(zhì)中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組。

4 病原分離鑒定

乳樣采集：用清潔水洗凈患病奶牛乳房，用潔凈紙巾擦干，然后用75%酒精棉擦拭采樣乳頭，棄掉前3～4把乳，將乳汁樣品采集到采樣管中，蓋好采樣管蓋子，并注明奶牛號(hào)及乳區(qū)，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

細(xì)菌分離與鑒定：取采集的擬檢驗(yàn)乳樣搖勻，接種含5%血液的瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，依據(jù)細(xì)菌實(shí)際生長(zhǎng)情況可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。在5%血液瓊脂平板培養(yǎng)24 h，無(wú)乳鏈球菌一般生長(zhǎng)成灰白色、圓形、光滑凸起、邊緣整齊、濕潤(rùn)、直徑為0.5～1.0 mm的小菌落，多呈β溶血。接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，初期肉湯外觀呈均勻性渾濁，培養(yǎng)后期肉湯變得較為清亮透明，管底出現(xiàn)絮狀、顆粒狀的沉淀，沉淀物易搖散。細(xì)菌革蘭氏染色為陽(yáng)性，細(xì)菌呈紫色，鏈狀排列。

CAMP試驗(yàn)：取血瓊脂平板，接種金黃色葡萄球菌，劃種一條直線，然后再接種分離菌株，與金黃色葡萄球菌劃線垂直接種，同樣劃種一條直線，但兩接種劃線不能相交，且兩者相距在0.5～1.0 cm之間，37 ℃孵育18～24 h。由于無(wú)乳鏈球菌可產(chǎn)生CAMP因子，該因子能激發(fā)金黃色葡萄球菌β溶血素的活性，因此，在血瓊脂平板兩種細(xì)菌的交界處因溶血力增強(qiáng)而形成箭頭狀的透明溶血區(qū)。

5 藥物治療

無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素類抗生素較為敏感，臨床病例治愈率較高，可達(dá)70%以上。然而，隨著藥物長(zhǎng)期大量不科學(xué)使用，無(wú)乳鏈球菌的耐藥性也日顯突出，并嚴(yán)重影響著臨床治療效果。由于一些無(wú)乳鏈球菌產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶或生物被膜，導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類等藥物產(chǎn)生了耐藥性。

在牛源無(wú)乳鏈球菌耐藥性研究方面，張莉莉等檢測(cè)了82株奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌的青霉素耐藥性，結(jié)果表明，在82株受試菌中對(duì)青霉素耐藥菌株占21.95%，說(shuō)明奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥率較高，試驗(yàn)同時(shí)證明，無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥性受β-內(nèi)酰胺酶、細(xì)菌生物被膜等多因子的調(diào)控。張成虎等試驗(yàn)表明，無(wú)乳鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素和四環(huán)素的耐藥率較高，在分離的無(wú)乳鏈球菌中，對(duì)青霉素耐藥的63.64%，對(duì)四環(huán)素耐藥的占34.55%。易明梅等試驗(yàn)證實(shí)，分離的無(wú)乳鏈球菌均對(duì)氨芐青霉素產(chǎn)生了耐藥性，對(duì)四環(huán)素和紅霉素也產(chǎn)生了部分耐藥性。上述學(xué)者研究證實(shí)，一些無(wú)乳鏈球菌菌株對(duì)四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生了抗藥性，因此，在治療無(wú)乳鏈球菌乳房炎時(shí)有條件牛場(chǎng)最好測(cè)定病原菌的藥敏性。

6 疫苗研發(fā)進(jìn)展

由于引起奶牛乳房炎的無(wú)乳鏈球菌一般不產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，所以至今仍無(wú)有效疫苗。然而，隨著科技進(jìn)步，在奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌疫苗研究方面一些學(xué)者取得了一定的進(jìn)展。

在無(wú)乳鏈球菌結(jié)構(gòu)蛋白中，菌體sip蛋白是位于菌體表面的一種保守性蛋白，該蛋白在各種血清型的無(wú)乳鏈球菌中均存在。目前，在無(wú)乳鏈球菌疫苗研究方面，菌體sip蛋白已成為重要的靶向免疫蛋白，同時(shí)，該蛋白還可作為檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的的候選蛋白。布日額等學(xué)者將無(wú)乳鏈球菌菌膜表面相關(guān)蛋白基因sip與磷酸甘油激酶基因pgk進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，并獲得了融合蛋白，融合蛋白能被無(wú)乳鏈球菌抗體識(shí)別，試驗(yàn)小鼠免疫接種sip蛋白后，能夠較好保護(hù)小鼠免受多種血清型的無(wú)乳鏈球菌的攻擊，該研究為奶牛無(wú)乳鏈球菌性亞單位疫苗的研究提供了技術(shù)支撐。 吳金花等利用奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌的溶血素基因hly構(gòu)建重組質(zhì)粒，試驗(yàn)表明，表達(dá)的產(chǎn)物具有良好的免疫原性。王雪吟等構(gòu)建了牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌菌毛島嶼AP1-AP2-BP三聯(lián)基因，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的純化蛋白作為牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌菌毛島嶼PI-2a亞單位重組抗原免疫家兔，制備多亞單位免疫抗體，結(jié)果表明，AP1-AP2-BP多亞單位抗原有較好的免疫原性，該研究為制備相應(yīng)多亞單位抗體的制備提供了良好的多價(jià)抗原，同時(shí)也為將研制新型工程疫苗及檢測(cè)試劑提供了科學(xué)研究基礎(chǔ)。蔣業(yè)慧等從某一奶牛場(chǎng)分離奶牛隱型乳房炎病原菌，從中篩選具有良好免疫原性的無(wú)乳鏈球菌制備滅活疫苗，免疫試驗(yàn)表明，牛場(chǎng)隱性乳房炎的發(fā)生率降低了37%，疫苗免疫效果較為理想。

7 監(jiān)測(cè)與凈化

無(wú)乳鏈球菌感染的奶牛是牛場(chǎng)的重要傳染源，因此，應(yīng)加強(qiáng)牛群的感染監(jiān)測(cè)，確保奶牛群的凈化。要加強(qiáng)奶牛的監(jiān)測(cè)與診斷，定期對(duì)全群奶牛進(jìn)行抽樣培養(yǎng)，新購(gòu)奶牛，以及新產(chǎn)奶牛應(yīng)在產(chǎn)犢后第3～4次擠奶時(shí)進(jìn)行取樣監(jiān)測(cè)，確診的陽(yáng)性病例，應(yīng)立即隔離并采取及時(shí)科學(xué)治療措施。

無(wú)乳鏈球菌是導(dǎo)致大罐奶體細(xì)胞數(shù)上升的主要病原，奶牛感染無(wú)乳鏈球菌后，大缸奶樣的體細(xì)胞數(shù)急劇升高，且大缸奶細(xì)菌總數(shù)顯著升高。如果大罐奶的體細(xì)胞數(shù)大于75萬(wàn)個(gè)/mL，提示奶牛無(wú)乳鏈球菌感染率可能較高，需要對(duì)全群泌乳奶牛進(jìn)行檢測(cè)與治療。大罐奶取樣做PCR檢測(cè)更利于掌握全群奶牛乳房健康狀況。據(jù)報(bào)道，牛群中如有一頭奶牛的一個(gè)乳區(qū)發(fā)生感染，就可能導(dǎo)致100頭奶牛所產(chǎn)奶的桶奶細(xì)菌數(shù)上升至10萬(wàn)/mL。牛群感染牛的治療與清除是保障奶牛健康的中藥途徑之一。無(wú)乳鏈球菌患牛須選擇敏感的藥物進(jìn)行治療，對(duì)于治療無(wú)效的奶牛應(yīng)進(jìn)行淘汰，從而有效控制制無(wú)乳鏈球菌感染。產(chǎn)3胎以上，乳汁體細(xì)胞數(shù)大于160萬(wàn)/mL，并持續(xù)時(shí)間3個(gè)月以上，或患有慢性乳房炎，且對(duì)治療不敏感的牛應(yīng)及時(shí)淘汰。