影響熒光定量PCR實驗準確性的因素剖析

李世鳳

(民樂縣畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅 民樂734500)

近年來，尤其是H7N9流感及非洲豬瘟疫情爆發(fā)后，熒光定量PCR診斷方法在基層動物疫病防控、檢疫檢驗、流行病學調查和疫病診斷中的優(yōu)勢越來越凸顯。PCP方法因其敏感性高、操作簡單、診斷周期短、準確性高的特點，已經成為基層畜牧獸醫(yī)業(yè)務部門最主要的診斷手段之一。

如何在最短的時間內做出最準確的判斷就顯得尤為重要。熒光定量PCR實驗必須在二級生物安全水平以上實驗室內、由技術過硬的專業(yè)人員精準操作下完成。因此，本文從以下3個方面，簡單分析影響實驗精準性的因素。

1 二級生物安全實驗室的運行基本要求

1.1 實驗室的選址要求

實驗室選址不僅要符合國家、當地的環(huán)境保護部門要求，也要復符合建設主管部門的要求。首先要了解這些要求并征得其部門同意和批準，方可進行實質性的設計和建設，不要盲目選址建設。要根據當地四季溫差、風向、溫度變化范圍、空氣濕度等自然條件，建在相對地勢較高、僻靜、交通相對便捷的地方。

1.2 實驗室建設要求

選址完成之后，建議請專業(yè)的實驗室設計人員，根據現(xiàn)有的條件，設施設計和規(guī)劃建設實驗室，充分考慮未來實驗室的使用方向和可能的發(fā)展趨勢。建設原則要符合各區(qū)獨立、注意風向、因地制宜、方便工作的原則。硬件設施要求越完善，越有利于運行管理。我縣的獸醫(yī)實驗室建在原民樂縣畜牧獸醫(yī)局辦公樓一樓，與辦公區(qū)域獨立分開，建設之前就在民樂縣環(huán)保局的備案。

1.3 建立完善的質量管理和生物安全管理體系

一個合格的獸醫(yī)實驗室必須要有規(guī)范的質量管理體系和生物安全管理體系并且嚴格執(zhí)行。我縣獸醫(yī)實驗室制定了完善的質量手冊、生物安全手冊、程序文件等，建立了嚴格的管理體系。

1.4 過硬的人員隊伍

獸醫(yī)實驗室管理人員必須要有防范大于治理的安全意識，把好質量安全和生物安全關。技術人員要掌握必要的理論基礎、積累一定的實驗室工作經驗并且掌握熒光定量PCR實驗工作原理、熟悉儀器設備、掌握不同試劑原理，最好人員隊伍固定。我縣獸醫(yī)實驗室現(xiàn)有專職實驗室工作人員3名，均在5年以上的實驗室工作經歷，都具備中級以上職稱。

1.5 合格的硬件設施及輔料

熒光定量PCR實驗對硬件設施要求高，必備的生物安全柜、離心機、移液器及常用的一些輔助試劑和耗材(采樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等)必須符合基本要求。

民樂縣動物疫病預防控制中心獸醫(yī)實驗室在2004年農業(yè)部動物防疫基礎設施建設項目和2017年獸醫(yī)實驗室能力提升建設項目的基礎上，對獸醫(yī)實驗室進行了改擴建。目前建筑面積達458平方米，設有解剖室、接樣室、檔案室、無菌室、血清學檢測室、病原學檢測室、分子生物學實驗室七個功能室。2020年5月通過甘肅省獸醫(yī)局的授權，開展非洲豬瘟熒光PCR檢測，止目前共檢測34批次2691份樣品，涵括血清、環(huán)境樣品、生豬運輸車輛及組織等。樣品覆蓋全縣的規(guī)模養(yǎng)豬場(戶)、生豬定點屠宰廠、輛運輸車輛。同時開展口蹄疫病毒及H5、H7流感病毒的檢測，累計完成3469份樣品的分子生物學檢測實驗。

2 樣品的采集、處理、保存和運輸

實驗樣品采集遵循適時、合理、典型、無菌、安全的原則。采集樣品時要根據不同的疾病或者檢驗目的，采集相應的臟器、內容物、分泌物、排泄物等，樣品要有代表性；同時做好自我安全防護，以免造成不必要的損傷。采樣結束后做好包裝、運送和記錄工作。并在最短的時間內送檢。

樣品的采集、處理、保存和運送時檢驗工作順利開展的基礎，樣品決定了實驗結果的可靠性。所以說樣品的采集、處理、保存和運送是十分重要的。具體采樣要求建議參考原農業(yè)部2002年8月頒布的“動物疫病實驗室檢驗采樣方法(NY/T541-2002)”。

3 人為因素

對于基層獸醫(yī)檢測人員來說，在實驗室已經建設好、現(xiàn)有的硬件設施及實驗室的輔料，影響實驗結果準確性最主要因素的是實驗過程的各種人為因素。筆者從事多年的基層獸醫(yī)實驗室工作，認為在現(xiàn)有的條件下，以下幾個方面是提高實驗準確性的關鍵環(huán)節(jié)。

3.1 實驗準備工作

實驗前的準備工作十分重要，但往往卻經常被忽視。首先要根據委托協(xié)議查看實驗目的，準備耗材、提前開啟儀器設備保證正常運行、所需試劑回溫及耗材查漏補缺等必備工作。其次檢查待檢樣品是否符合實驗要求，如符合須先處理樣品(包括置盲、留樣及滅活、稀釋等前期工作)，實驗前樣品處理(樣品滅活)可避免污染實驗室的現(xiàn)象發(fā)生，留樣是復檢的前提。

3.1.1 確定耗材及以前配件是否使用正確 耗材對于熒光定量PCR來說比較重要，很多異常擴增曲線是由于耗材使用不當引起的。常見的有錯誤使用普通PCR儀器所對應的耗材，透光性太差，可能會出現(xiàn)打折的曲線。沒有選擇跟儀器加熱模塊規(guī)格匹配的耗材。造成反應管外壁與熒光定量PCR儀器溫控模塊沒有充分接觸，熱傳導不充分進而影響酶的活性，出現(xiàn)假陰性的結果。使用質量差的耗材可能出現(xiàn)熒光值不穩(wěn)定得到的CT值不穩(wěn)定。

3.1.2 確認所有試劑是否正確 確認試劑是否有效，核查有效期、運輸條件、是否反復凍融等。若以上任何一項不符合，建議廢棄不用以免影響實驗準確性。

3.2 實驗過程

實驗過程簡單的說就是按照試劑說明書完成核酸提取、體系配制、擴增分析三個過程。其中最關鍵的環(huán)節(jié)核酸提取、體系配置。整個過程需要在獨立的區(qū)域內(即準備區(qū)、配置區(qū)、擴增分析區(qū))、按照單向移動(潔區(qū)到污區(qū))的原則完成。

這個階段要求實驗室工作人員手穩(wěn)、手快、心細。我認為熒光定量PCR實驗的以下操作細節(jié)要特別注意：

3.2.1 從冰箱冷凍取出的試劑是否混合均勻 提取核酸加樣是否精準、倒廢液的時候是否污染了手套及操作臺面、離心管蓋是否蓋嚴實、離心過程進來避免甩開管蓋等。

3.2.2 擴增之前加樣是否精確 有沒有掛在八連管管壁、八連管蓋密閉性檢查、八連管與PCR儀有沒有充分接觸、八連管內有沒有氣泡等等。

3.2.3 確認軟件設置是否正確 對照試劑盒說明書，檢車時間、溫度、循環(huán)數、熒光采集等設置是否正確。

如果以上都正常，一般來說不會出現(xiàn)異常的擴增曲線。但是個別情況下還是會出現(xiàn)，這就要求實驗室工作人員具備判斷數據結構的能力，為什么會出現(xiàn)異常曲線以及怎么避免出現(xiàn)異常曲線。

3.3 實驗室去污染和廢棄物處理

實驗結束后對樣本、設備、操作臺面及操作間等進行清潔、消毒、滅菌是最后環(huán)節(jié)。結合本人工作實際，PCR實驗廢棄物經過高壓滅菌之后，交于醫(yī)療廢棄物處理機構統(tǒng)一處理。操作臺面、生物安全柜、移液器、試管架等硬件設施通過84消毒液噴灑--核酸去除劑噴灑--酒精擦拭三步法，輔以紫外燈照射徹底消毒。為下次實驗做準備。

綜上所訴，在實驗室建設運行情況良好的情況下，符合樣品符合檢測要求、技術過硬的工作人員三個必備條件下，注意操作細節(jié)，選用合適的耗材及輔料，嚴謹細致的工作態(tài)度，才能克服影響因素從而大大提高實驗準確性，為快速準確的判斷疫情、檢疫檢驗結果提供判斷依據。