牛結(jié)核病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

羅鵬飛，舒 展

(阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心,新疆 阿勒泰 836500)

牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis,TB)是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis, M bovis)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的一種慢性消耗性人獸共患傳染病，袁溶英研究了牛結(jié)核病臨床癥狀，其臨床上一般難以發(fā)現(xiàn)典型癥狀和病變。Vordermeier H M等學(xué)者報(bào)道，全球牛結(jié)核病流行率為9%。陳淑瓊等報(bào)道，全球畜牧業(yè)的發(fā)展中約有5000萬頭牛患有牛結(jié)核病。張喜悅等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，我國個(gè)別地區(qū)牛群中牛的感染率達(dá)9.6%，Vordermeier H M等學(xué)者報(bào)道，全球每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)30億美元。張高迪等學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牛結(jié)核中有7%系人分支桿菌感染，而結(jié)核病人中10.6%為牛分支桿菌感染。才吉報(bào)道，通過世界衛(wèi)生組織的實(shí)際調(diào)查，平均每年會(huì)有300萬人因患有牛結(jié)核病而死亡，不僅對(duì)我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重影響，而且還對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。潘福寶等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，我國人畜結(jié)核病雖然在一定時(shí)期內(nèi)得到了控制，但是根據(jù)近年來的相關(guān)數(shù)據(jù)，該病的發(fā)病率又呈現(xiàn)增長(zhǎng)，這應(yīng)引起高度重視，且應(yīng)給予大量人力、物力和財(cái)力加以防治。

1 牛結(jié)核病病原學(xué)概述

張秀華等學(xué)者報(bào)道，牛結(jié)核病是養(yǎng)牛過程中較為常見的一種人畜共患性慢性消耗性傳染病，其病原是分枝桿菌屬的3個(gè)種，即牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和禽型分枝桿菌(Mycobacterium avium)。本病會(huì)引起牛只多種組織以及器官內(nèi)出現(xiàn)結(jié)節(jié)性肉芽腫和干酪性壞死灶，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)慢性消耗性疾病，病牛普遍壽命縮短，患病奶牛產(chǎn)奶量明顯減少甚至出現(xiàn)不孕癥狀。奶牛是最易感染結(jié)核病的家畜，病牛的鼻液、痰液、糞便和乳汁等均可通過空氣、經(jīng)口、撕咬以及垂直傳播的方式將疾病傳播給人類以及其他動(dòng)物，引發(fā)相關(guān)感染。懷孕的母?？梢越?jīng)過胎盤傳播給胎兒，造成新生犢牛感染結(jié)核桿菌。牛結(jié)核病具備較廣的感染宿主，絕大多數(shù)溫血脊椎動(dòng)物均可感染。

2 牛結(jié)核病研究進(jìn)展現(xiàn)狀

1998年，通過公布結(jié)核分枝桿菌H37RV基因組序列的初步分析結(jié)果，表明結(jié)核桿菌研究進(jìn)入到了結(jié)構(gòu)以及功能基因組學(xué)時(shí)代。通過構(gòu)建牛結(jié)核桿菌基因文庫，方便分離基因，采取適宜的探針通過分子雜交等即可篩選目的基因。利用牛結(jié)核桿菌基因文庫來鑒定牛結(jié)核桿菌基因及抗原，并對(duì)其特征進(jìn)行分析，即可實(shí)現(xiàn)有效的診斷。鄭素華等學(xué)者研究了牛結(jié)核分枝桿菌多肽抗原，通過比較結(jié)核分枝桿菌以及牛結(jié)核分枝桿菌多肽抗原發(fā)現(xiàn)，分子量為28 000、34 000以及40 000多肽為較特異性的多肽抗原成份。

對(duì)基因組學(xué)進(jìn)行比較是一種有效的鑒定遺傳變異的方法，通過遺傳變異可比較出生物體在生理、生化以及毒力等方面所存在的差異。通過公布結(jié)核桿菌全基因組序列，使人類得以利用定制的細(xì)菌人工染色體陣列作為模版，以不同結(jié)核桿菌全基因組作為探針來開展雜交試驗(yàn)。

病原菌在侵害機(jī)體時(shí)，常常遭到吞噬細(xì)胞的吞噬，菌體類脂質(zhì)可以對(duì)吞噬細(xì)胞溶酶體的作用進(jìn)行有效對(duì)抗，在吞噬細(xì)胞內(nèi)以細(xì)菌的形式寄生。接著形成帶菌免疫，這種帶菌免疫主要為細(xì)胞免疫，導(dǎo)致傳染性免疫以及傳染性變態(tài)反應(yīng)同時(shí)產(chǎn)生并且同時(shí)存在。何昭陽等學(xué)者報(bào)道，在肉芽形成以后，隨著病情的發(fā)展逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤狀的結(jié)核結(jié)節(jié)增生，導(dǎo)致結(jié)節(jié)異常增大。在肉芽的生長(zhǎng)作用下壞死灶逐漸蔓延至心肌部位，其中心部門逐漸縮小，同時(shí)因發(fā)生鈣化以及液化而轉(zhuǎn)變?yōu)槌矢衫覡畹膱F(tuán)塊。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的結(jié)核結(jié)節(jié)常常轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅苄缘睦w維組織，導(dǎo)致該病停止發(fā)展。在淋巴液以及血液的流動(dòng)作用下，結(jié)核分枝桿菌發(fā)生轉(zhuǎn)移并且其他器官以及組織中定居，導(dǎo)致其他結(jié)核結(jié)節(jié)區(qū)的形成，引起器官病變，雖然病變廣泛分布，但是在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)其病理變化并不明顯，不存在任何臨床癥狀,隨著結(jié)核感染大量進(jìn)入淋巴液以及血液,腎臟以及肺臟等主要器官中逐漸形成大量的結(jié)核結(jié)節(jié)，這一過程屬于致命的感染。從早期感染往往需要經(jīng)過幾個(gè)月才能出現(xiàn)鈣化以及液化的干酪結(jié)節(jié)，宿主相關(guān)免疫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)能、潛伏期內(nèi)細(xì)菌的增值程度直接決定著該病的抑制、發(fā)展、病灶的蔓延擴(kuò)大。

如果機(jī)體具備較強(qiáng)的抵抗力，吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌就會(huì)在局部滯留導(dǎo)致原發(fā)性結(jié)核結(jié)節(jié)的出現(xiàn)，這種結(jié)節(jié)可能終身不擴(kuò)散。但是如果機(jī)體抵抗力較弱，細(xì)菌常常在淋巴管的擴(kuò)散作用下繼發(fā)結(jié)核結(jié)節(jié)病灶，在血液的作用下甚至導(dǎo)致全身性結(jié)核結(jié)節(jié)的出現(xiàn)。

結(jié)核桿菌可以導(dǎo)致超過50種哺乳動(dòng)物以及25種禽類發(fā)病。牛是最容易感染結(jié)核病的家畜,尤其是奶牛其發(fā)病率最高，其余分別為水牛以及黃牛，除了牛只外，豬、家禽也容易感染結(jié)核桿菌,羊以及馬感染概率較低。在全世界范圍內(nèi)牛結(jié)核病均有發(fā)生，該病的發(fā)生不存在明顯的季節(jié)流行性，可常年發(fā)生。其主要傳染源為病牛，病牛呼吸道內(nèi)的分泌物可以通過咳嗽傳播至空氣當(dāng)中，或者隨著生殖器官分泌物、鼻液、乳汁、唾液、痰液等排出體外，對(duì)空氣、飲水以及飼料等造成污染。絕大多數(shù)情況下，成年牛通過被污染的塵埃或者飛沫而感染，犢牛則主要經(jīng)過飲水、飼料以及乳汁等感染。

崔基賢等學(xué)者報(bào)道，在全世界范圍內(nèi)牛結(jié)核病均有發(fā)生，隨著消滅牛結(jié)核病計(jì)劃的順利，截至到當(dāng)前美國基本已經(jīng)不存在結(jié)核病牛群。但是人類結(jié)核病、野生動(dòng)物結(jié)核病以及觀賞動(dòng)物結(jié)核病的存在，導(dǎo)致牛只隨時(shí)可能遭到感染，因而在美國牛結(jié)核病仍受到了較高的重視。2003年，我國從美國引入142頭良種奶牛當(dāng)中，廣東檢驗(yàn)總局供檢驗(yàn)出19例陽性種牛，使得美國25年來不存在牛結(jié)核病的神話徹底打破。

在我國，很早以前就有牛結(jié)核病的記載，尤其到了上世紀(jì)40年代以后，由于從國外大量引入奶牛，導(dǎo)致家畜結(jié)核病在我國廣泛流行。上世紀(jì)50年代我國大規(guī)模暴發(fā)牛結(jié)核病，通過人們的長(zhǎng)期不斷努力，牛結(jié)核病陽性率明顯降低。到了70年代,我國奶牛產(chǎn)業(yè)得到了快速的發(fā)展，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，牛結(jié)核病廣泛流行，一些地區(qū)牛結(jié)核病陽性率甚至達(dá)到了64.7%。到了80年代，該病的流行逐漸放緩，但是其感染率仍然較高。在我國，牛結(jié)核病的發(fā)生造成了經(jīng)濟(jì)損失。

3 牛結(jié)核病診斷研究進(jìn)展

當(dāng)前，國內(nèi)外對(duì)于牛結(jié)核病的檢測(cè)方法主要包括細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)、免疫學(xué)檢驗(yàn)及分子生物學(xué)方法3種。

3.1 細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)

Wolf A J等學(xué)者研究了牛結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，首先為細(xì)菌培養(yǎng)以及涂片鏡檢等病原學(xué)檢查方法，這是較為常見的一種方法，但是結(jié)核菌需要8周左右這一較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。李樹春研究報(bào)道，在進(jìn)行牛結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)時(shí)大約有10% ～ 20%的病例存在培養(yǎng)失敗的問題。與此同時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)的檢出率較低，其敏感性較差，加之郭海晏等學(xué)者(2002年)報(bào)道，其缺乏敏感性及特異性，無法使當(dāng)前牛結(jié)核病的臨床診斷需求得到滿足。

3.2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是臨床診斷中得到廣泛應(yīng)用的一種診斷方法，較為常見的為牛結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)以及間接ELISA檢測(cè)方法，這兩種診斷方法敏感性較高，特異性較強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，可以應(yīng)用于牛結(jié)核病的普查。當(dāng)前，牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)已經(jīng)在牛結(jié)核病的檢疫診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。Cousins D V等學(xué)者報(bào)道，ELISA法、PCR方法也是較為常見的一種實(shí)驗(yàn)室診斷方法，雖然其操作較為便利，但是需要較高的檢測(cè)成本，因而很難實(shí)現(xiàn)有效的落實(shí)以及推廣。

3.3 分子生物學(xué)方法

主要包括PCR、核酸探針以及DNA圖譜等分子生物學(xué)方法。這一類方法具備較強(qiáng)的敏感性以及特異性，但是其檢測(cè)過程中需要特殊的儀器設(shè)備，檢測(cè)技術(shù)性較強(qiáng)，操作過于復(fù)雜，對(duì)操作人員以及實(shí)驗(yàn)室條件提出了較高的要求。因此，僅僅在實(shí)驗(yàn)室研究有所應(yīng)用，很難在基層推廣使用。

牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)雖然具備明顯的不足之處，但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中，楊光旭等學(xué)者報(bào)道，牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是國家動(dòng)物結(jié)核病檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前，這種方法在動(dòng)物結(jié)核病以及人結(jié)核病免疫診斷時(shí)得到了廣泛的應(yīng)用。張玉環(huán)報(bào)道，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和我國都將此方法列為牛結(jié)核病檢疫的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。ELISA方法以及抗體免疫金標(biāo)方法等其他檢測(cè)牛血清抗體的方法，均因成本過高，同時(shí)操作不便，無法在獸醫(yī)臨床試驗(yàn)得到有效應(yīng)用。何昭陽等學(xué)者比較了ELISA方法與變態(tài)反應(yīng)方法檢測(cè)奶牛結(jié)核病的情況，得到的結(jié)論為：變態(tài)反應(yīng)陽性并不能全包括ELISA陽性，變態(tài)反應(yīng)與剖檢及細(xì)菌學(xué)檢查的符合率分別為18.8%和7.2%。陳穎鈺等學(xué)者報(bào)道，目前ELISA方法以及抗體免疫金標(biāo)方法等其他檢測(cè)牛血清抗體的方法僅被作為牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的輔助診斷方法。

4 展望

牛結(jié)核病作為一種慢性消耗性傳染病，其傳染性較強(qiáng)。近年來，我國養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)得到了迅速的發(fā)展，牛群數(shù)量的增加在一定程度上提高了各種傳染性疾病發(fā)生的概率，如果未及時(shí)采取行之有效的措施對(duì)人畜共患病進(jìn)行綜合防控以及凈化，會(huì)在很大程度上威脅社會(huì)公共衛(wèi)生安全。由于結(jié)核病存在細(xì)胞免疫和體液免疫分離現(xiàn)象，無論是牛型結(jié)核菌素PPP皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、γ-干擾素體外釋放試驗(yàn)還是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法都難以準(zhǔn)確無誤地診斷牛結(jié)核病，目前確診牛結(jié)核病比較理想的方法是兩種或兩種以上方法的聯(lián)合使用。因此，今后除需要在使用現(xiàn)有方法或技術(shù)診斷牛結(jié)核的基礎(chǔ)上，繼續(xù)開展牛結(jié)核病診斷新方法、新技術(shù)的試驗(yàn)研究，最大限度地提高診斷的準(zhǔn)確性，尤其是在農(nóng)牧區(qū)應(yīng)用準(zhǔn)確、高效、快速的牛結(jié)核病診斷方法或技術(shù)至關(guān)重要，開展牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查不僅可以幫助獸醫(yī)人員掌握牛結(jié)核病流行趨勢(shì)，還能有效預(yù)防該病的傳染。