淺議薄層色譜及中藥成方制劑的方法建立

劉冰，劉松雁， 高慶輝，張蕾，謝亮，呂潔

（1.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測(cè)中心 050000；2.新樂市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 050000；3.石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 050000）

薄層色譜法是指將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。 待點(diǎn)樣、展開后，與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖作對(duì)比，用以進(jìn)行藥物的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定的方法，由于其快速、操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、顯色容易等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于中藥成分分析中。

1 影響薄層色譜質(zhì)量的主要因素

1.1 溫度

展開缸空間分布的展開劑中各溶劑蒸汽的比例發(fā)生變化會(huì)影響待分離物質(zhì)的展開，在濕度恒定時(shí)，一般在較高溫度展開時(shí)的Rf 值高，反之則低，一般展開溫度保持在15℃～25℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)也必須在實(shí)驗(yàn)記錄中體現(xiàn)溫度。

1.2 吸附劑的活性和相對(duì)濕度的影響

吸附劑的活性一般由表面能和表面積決定，其中活潑型及游離型的硅醇基數(shù)目決定硅膠活性，硅醇基是親水性基團(tuán)，吸附水后形成水和硅醇基失去活性，所以在其他條件相同的情況下，薄層板的活性與實(shí)驗(yàn)環(huán)境的濕度有直接影響。 但有的樣品分析和使用的展開劑對(duì)相對(duì)濕度有較寬的適應(yīng)能力，在30%～70%都可以得到穩(wěn)定的色譜。 因?yàn)榈貐^(qū)氣候影響，環(huán)境濕度可能會(huì)有所不同，所以記錄實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)濕度是很有必要的，一般控制在小于50%左右。 可以在實(shí)驗(yàn)室中加裝空氣加濕器或者除濕器來(lái)控制大環(huán)境中的濕度， 也可以轉(zhuǎn)移到加入五氧化二磷或者硫酸的干燥器中控制濕度，也可以在放入變色硅膠的展開缸中控制，同時(shí)我們也能選擇自動(dòng)展開設(shè)備，如自動(dòng)展開儀來(lái)控制相對(duì)濕度。

1.3 溶劑蒸汽影響

薄層色譜展開過程中，展開劑的蒸汽相、液相、固定相形成作用機(jī)制復(fù)雜的色譜過程， 如果處理不到位就會(huì)影響斑點(diǎn)分離度，或者展開過程中展開劑的組分被固定相分離產(chǎn)生第二前沿，或者平衡時(shí)間不夠產(chǎn)生邊緣效應(yīng)， 這些都會(huì)影響薄層色譜的質(zhì)量。

1.4 薄層板的質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)過程中目前一般都使用商品薄層板，以保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，在建立方法時(shí)，也應(yīng)該考慮不同品牌的薄層板質(zhì)量和層析效果，以保證方法的通用性良好。 實(shí)驗(yàn)過程中也應(yīng)該記錄薄層板的廠家、型號(hào)、批號(hào)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可追溯和可重復(fù)。

1.5 點(diǎn)樣技術(shù)

點(diǎn)樣過程中點(diǎn)樣體積過大會(huì)降低分離效率， 還會(huì)產(chǎn)生點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)，這種效應(yīng)會(huì)對(duì)之后的線性展開造成不良影響，所以在配置樣品溶液時(shí)應(yīng)該選用對(duì)組分溶解度較小的溶劑， 且溶劑粘度不能太高，沸點(diǎn)要適中，沸點(diǎn)過低時(shí)會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)造成樣品溶液濃度改變，沸點(diǎn)過高又會(huì)導(dǎo)致樣品溶液在原點(diǎn)殘留，導(dǎo)致改變展開劑的選擇性。實(shí)驗(yàn)中推薦使用溶劑甲醇和乙醇。 點(diǎn)樣后應(yīng)該除去原點(diǎn)殘存溶劑，比如用吹風(fēng)機(jī)吹干，而且要避免點(diǎn)樣裝置對(duì)薄層表面產(chǎn)生機(jī)械損傷。

1.6 樣品預(yù)處理與供試品溶液的制備

供試品溶液的制備原則是在不犧牲圖譜質(zhì)量的前提下，操作越簡(jiǎn)單越好，減少不必要的回流和過柱。 如果預(yù)處理與制備不合理，會(huì)產(chǎn)生斑點(diǎn)不圓、不完整、不清晰、背景干擾嚴(yán)重或者斑點(diǎn)過少，失去圖譜的特征性。

2 薄層色譜常見問題

2.1 邊緣效應(yīng)

邊緣效應(yīng)是指同一種化合物在同一塊薄層板上用相同展開劑在同一展開室內(nèi)展開后， 薄層板中部的斑點(diǎn)比薄層兩側(cè)邊緣處的斑點(diǎn)Rf 值小的現(xiàn)象。為了克服這一問題，可以增加展開室中溶劑蒸汽飽和度， 選擇單一展開劑或共沸展開劑代替混合展開劑， 采用窄薄的薄層板， 或者在薄層板兩側(cè)各去除5mm 的吸附劑，通過這些方式可以減小或者消除邊緣效應(yīng)。

2.2 拖尾

拖尾現(xiàn)象是指點(diǎn)樣雖在同一垂直線而圓心未重合， 在圓形或者橢圓形斑點(diǎn)的后方呈現(xiàn)拖尾，嚴(yán)重時(shí)呈現(xiàn)倒火焰狀。 實(shí)驗(yàn)中通過控制點(diǎn)樣量，展開劑pH 值，吸附劑pH 值，去除痕量金屬離子可以避免發(fā)生拖尾現(xiàn)象。

2.3 斑點(diǎn)念珠狀

斑點(diǎn)念珠狀是指化合物的斑點(diǎn)之間距離小， 斑點(diǎn)相互重疊或者連接的狀態(tài)。 產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因是單一的化合物產(chǎn)生了分解，或者形成了絡(luò)合物，以及被層析樣品中組分過多導(dǎo)致在薄層板上無(wú)法分開，或在原點(diǎn)點(diǎn)樣時(shí)形成復(fù)斑。

2.4 Rf 值不穩(wěn)定

層析時(shí)溫度變化，層析時(shí)間不恒定，吸附劑規(guī)格不統(tǒng)一，薄層板、展開劑廠家型號(hào)不同，展開劑反復(fù)使用這些因素都會(huì)產(chǎn)生Rf 值不穩(wěn)定的現(xiàn)象。

2.5 斑點(diǎn)異形

斑點(diǎn)異形產(chǎn)生是因?yàn)槲絼┝６然疃绕停?薄層板厚度不均勻，展開時(shí)層析缸被挪動(dòng)等因素。

3 中藥成方制劑的方法建立

在方法建立時(shí)，應(yīng)充分參考藥材和飲片的中藥鑒別方法，即與藥材飲片的專屬鑒別方法保持一致。 如果有其他成分干擾或者制劑的提取方法不同，不能采用與該藥材相同的鑒別方法時(shí)，可采用其他鑒別方法。 如處方相同，劑型不同的制劑，其鑒別方法應(yīng)保持一致。 并且盡可能采用一個(gè)供試品溶液多項(xiàng)多維鑒別使用的薄層色譜法，達(dá)到節(jié)約資源、保護(hù)環(huán)境、簡(jiǎn)便實(shí)用的目的。

方法建立過程中涉及到供試品溶液的制備， 應(yīng)該首先除去干擾物，并且方法盡量簡(jiǎn)單便捷，采用提取、純化選擇，如回流超聲提取的方式，還要對(duì)溶劑、時(shí)間、酸堿處理、溶劑萃取、柱層析優(yōu)化等。 其中柱層析跟薄層色譜層析類似，色譜柱的品牌填料、裝填等都會(huì)影響薄層色譜的結(jié)果。 對(duì)對(duì)照物的選擇應(yīng)該盡量采用以對(duì)照品和對(duì)照提取物或?qū)φ账幉耐瑫r(shí)進(jìn)行對(duì)照的方式，如對(duì)照品不易獲得時(shí)，可以采用對(duì)照提取物或?qū)φ账幉臑閷?duì)照，遇到對(duì)照藥材較多斑點(diǎn)有干擾時(shí)， 應(yīng)該選擇專屬性對(duì)照品或者對(duì)照藥材某個(gè)具有鑒別特征的斑點(diǎn)。 薄層板應(yīng)對(duì)吸附劑進(jìn)行比較，最終選擇聚酰胺板、硅膠G 板或者硅膠GF254 板來(lái)進(jìn)行層析。建立方法時(shí)要對(duì)三個(gè)以上的展開系統(tǒng)進(jìn)行比較， 對(duì)顯色條件進(jìn)行考察，比如選擇日光、紫外燈或者選用噴顯色劑進(jìn)行顯色。 點(diǎn)樣過程中應(yīng)選擇適宜的點(diǎn)樣量，點(diǎn)樣量過小會(huì)造成斑點(diǎn)不顯色，過大則會(huì)產(chǎn)生拖尾等影響色譜質(zhì)量的情況。 做成方制劑的薄層色譜鑒別是應(yīng)做陰性空白實(shí)驗(yàn)，以證明其他藥味沒有干擾。 建立方法中應(yīng)考察不同品牌薄層板的層板溫度等耐用性參數(shù)的考察。