mNGS在肺部感染中的診斷標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)本選擇研究進(jìn)展

吳 娜 李永霞

1. mNGS概況

1.1 mNGS發(fā)展史 宏基因二代測序(metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS)也叫作高通量測序。宏基因組是指生物環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，它包含了可培養(yǎng)和未可培養(yǎng)的微生物基因(包括細(xì)菌、病毒、真菌及其他病原體)。二代測序是相較于一代測序(Sanger測序)而言的，20世紀(jì)70年代Sanger利用雙脫氧鏈終止法測序技術(shù)首次測定了噬菌體X174的基因組序列，全長5375個堿基，后來將這種方法稱為Sanger法，這標(biāo)志著人類基因時代開始[1]。一代測序準(zhǔn)確性高，設(shè)備運行時間短，但是每次反應(yīng)只能得到一條序列，測序通量較低，耗費成本高，不能滿足人類對龐大基因庫的測序需求。2001年在Sanger法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)完成了第一個人體全基因組測序。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，宏基因二代測序應(yīng)運而生，即mNGS。mNGS是利用通量較高的二代測序技術(shù)對送檢樣本宏基因組獨立或并行進(jìn)行測序。它能夠測序出臨床樣本中幾乎所有人類已知的病原微生物基因，因此測序深度大，覆蓋面廣，且2000年后mNGS成本下降了近5萬倍，目前一次測序3000余人民幣便可完成，并且測序數(shù)據(jù)量增加1000倍左右[2]，運行效率高，這推動了其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛利用。

1.2 mNGS用于病原學(xué)診斷 2008年和2011年，Palacios等[3]與Xu等[4]分別采用宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了兩個臨床感染病例的新發(fā)病原體，分別為沙粒病毒和新型布尼亞病毒，開啟了宏基因組學(xué)測序(mNGS)技術(shù)在感染中應(yīng)用的先例。首次用于感染病原體診斷是在2014年，一個患有先天性聯(lián)合免疫缺陷綜合征的14歲小男孩在波多黎各旅游回國后反復(fù)高熱，醫(yī)生考率為自身免疫性腦炎，便使用糖皮質(zhì)激素治療，后男孩的病情惡化，出現(xiàn)了嚴(yán)重的腦積水和無法控制的癲癇發(fā)作，并一度陷入昏迷。住院期間(6周內(nèi))還應(yīng)用了38項感染病原體檢測，先后更換了5種抗菌藥物[5]，小男孩病情均無改善。C.Y.Chiu教授對小男孩的腦脊液做mNGS檢測，測序結(jié)果表明，大多數(shù)序列屬于人類，有400多個序列指向鉤端螺旋體，便采用大劑量青霉素治療，小男孩得以成功診治[6]。Wilson[7]將此病例發(fā)表，mNGS成為感染病原體診斷方面的研究熱點，后來相繼將本方法應(yīng)用于肺部感染[8]、感染性心內(nèi)膜炎[9]、感染性胰腺壞死[10]、關(guān)節(jié)感染[11]等。肺因氣體交換直接與外界相通，這種生理學(xué)特性決定了肺部感染高發(fā)病率。既往認(rèn)為肺部穩(wěn)態(tài)需要無菌，而健康肺部是有菌的，且菌群隨著黏膜擺動和氣流而移動[12]。肺部菌群的多樣性和多變性也導(dǎo)致肺部感染傳統(tǒng)培養(yǎng)方法病原體診斷陽性率低，且上呼吸道感染常常是病毒，病毒變異較快且只能檢測已知病毒，mNGS發(fā)揮了重要作用[13]。因此，mNGS可以提高肺部感染病原體檢出率，特別是對病毒、真菌及特殊病原體更有優(yōu)勢[14，15]。

2. mNGS結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

目前對于mNGS結(jié)果的判讀仍缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，閱讀Fang X、Chen X、Li Y等人以及現(xiàn)已發(fā)表的大量文獻(xiàn)[16～21]，將mNGS結(jié)果判讀總結(jié)如下：(1)測序覆蓋率排名前10的病原體中，序列數(shù)>3。(2)病原體的相對豐度在屬水平>30%。(3)傳統(tǒng)檢測方法與mNGS檢測出共同的病原體，且來自該病原體的獨特序列片段>50；若序列數(shù)<50,但符合臨床診療也可診斷。(4)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(分枝桿菌、諾卡氏菌除外)檢出序列數(shù)是相同類型微生物的10倍。(5)病毒比對序列數(shù)>100。(6)mNGS檢測到的真菌序列數(shù)是其余所有真菌的5倍以上。(7)結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、嗜肺軍團(tuán)菌序列數(shù)≥1。(8)若僅mNGS檢測陽性，則該病原體被認(rèn)為是疑似病原體，需滿足以下兩點：①文獻(xiàn)證實該病原體有肺部致病性；②每百萬閱讀序列比正常人陰性對照高出2倍。(9)mNGS陰性結(jié)果在排外感染性疾病方面具有較高的價值。

總而言之，mNGS結(jié)果應(yīng)以測序深度、序列數(shù)量、覆蓋度、置信度、相對豐度數(shù)值作為參考，臨床醫(yī)生結(jié)合患者臨床流行病學(xué)、病史、體征、實驗室檢查炎性指標(biāo)、胸部CT影像學(xué)等方面綜合判斷[21]。

3. mNGS檢測肺部感染的標(biāo)本選擇

mNGS的原理是對臨床樣本中來自人體和微生物的所有核酸序列進(jìn)行檢測，微生物核酸序列占總核酸序列不足5%，且不同臨床樣本人源性核酸含量不同，單位體積人核酸含量排序為：胸腹水>痰液>血漿>支氣管肺泡灌洗液>腦脊液，人源性核酸含量越多，對結(jié)果的靈敏度及特異度干擾越大，堿基序列片段的檢測敏感度閾值越大[22]。不同類型感染時病原體分布不同，因此每一種臨床樣本在mNGS檢測病原體中各有優(yōu)勢。

3.1 血液 血液標(biāo)本采集方便，臨床中比較容易獲得。肺組織血供豐富，肺部感染時病原體及其分解片段可進(jìn)入血液，從而能夠被檢測到，當(dāng)發(fā)生菌血癥或膿毒血癥時，血液檢測為最佳標(biāo)本。血液可避免口腔定植菌的干擾，采集過程中受污染的可能性也較小。盡管血液靈敏度不如肺泡灌洗液，當(dāng)患者不能耐受支氣管鏡而無法獲得支氣管肺泡灌洗液時，血液可作為檢測標(biāo)本。而且重癥肺炎常常并發(fā)血流感染，Chen J[23]等人將20例重癥肺炎患者的血液和BALF同時行mNGS檢測發(fā)現(xiàn)，有10例患者血液和BALF均為陽性，且血液與BALF中的病原體高度一致，這一結(jié)果表明重癥肺炎50%可能合并血流感染，此時血液與BALF具有同樣的敏感性。

3.2 痰液 肺部感染患者痰培養(yǎng)是一項常規(guī)檢查，痰液里病原體較多，容易被檢出。痰液采集過程及采集方式對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大，經(jīng)口咳出痰液最容易獲得，對患者無創(chuàng)傷，但痰液經(jīng)上呼吸道、口腔咳出會帶入口腔定植菌，而對于深部肺組織感染代表性較差，從而干擾結(jié)果的判讀；經(jīng)吸痰管吸取深部痰，可避免口腔定植菌干擾，但只有氣管插管建立人工氣道的危重患者才能獲得，且吸痰管會損傷患者氣道黏膜，加重缺氧或誘發(fā)肺不張等。痰液里人源性核酸含量多于血液和BALF，因此若選擇痰液送檢，結(jié)果分析時應(yīng)綜合考慮排除定植菌和污染。然而，痰液檢測非結(jié)核分枝桿菌優(yōu)于其他方法，繆青[24]等人研究中，83例痰標(biāo)本傳統(tǒng)培養(yǎng)檢出47例，mNGS檢出19例，mNGS方法檢出例數(shù)肺泡灌洗液(33)>肺組織(25)>痰液(19)，由此可得出在非結(jié)核分枝桿菌檢測中痰培養(yǎng)具有顯著優(yōu)勢，當(dāng)臨床懷疑結(jié)核或肺結(jié)核分枝桿菌感染，可將選擇痰液作為標(biāo)本送檢。

3.3 經(jīng)氣管鏡獲得標(biāo)本—肺泡灌洗液(BALF)、經(jīng)支氣管鏡肺活檢組織(TBLB)、支氣管針?biāo)?biāo)本(BB) 經(jīng)氣管鏡可獲得BALF、TBLB、BB等標(biāo)本，這些標(biāo)本均可大大避免口腔及上呼吸道定植菌的干擾，且防污染支氣管肺泡灌洗也減少了污染的機會，因此這些標(biāo)本均可提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于支氣管鏡為侵入性檢查，需評估患者的氧飽和度及肺部情況，若不能耐受支氣管鏡時應(yīng)選擇其他標(biāo)本進(jìn)行檢測。Wang Q[25]等的一項研究比較了通過mNGS診斷周圍肺部感染在經(jīng)支氣管肺活檢組織(TBLB)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、支氣管針?biāo)?biāo)本(BB)、以及TBLB+BALF+BB聯(lián)合等四種不同標(biāo)本的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在診斷細(xì)菌感染方面，TBLB、BALF、BB以及TBLB+BALF+BB四者敏感性無明顯差異；而在診斷真菌感染及未分類病原體感染方面，敏感性TBLB+BALF+BB>BB>BALF>TBLB；TBLB特異性最高，其次是BB、BALF。因此當(dāng)臨床懷疑真菌及不明原因的病原體感染時，可通過支氣管鏡獲取TBLB、BALF、BB進(jìn)行聯(lián)合檢測，提高病原體檢出率。

目前研究中mNGS檢測肺部感染絕大多數(shù)采用肺泡灌洗液，肺泡灌洗液人源性核酸含量最低，對結(jié)果干擾最小，而且樣本來自深部肺組織，對深部肺部感染有較好的代表性。大量研究也證實肺泡灌洗液檢測效率優(yōu)于血液和痰液。Chen X[18]等人的研究采用配對設(shè)計比較了血液和肺部灌洗液在肺部感染中的診斷效能，結(jié)果顯示肺泡灌洗液檢測靈敏度高于血液(81.3%>25.0%，P=0.003)；而特異度血液略高于肺泡灌洗液(84.6%>76.9%，P=0.317),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上所述，BALF是肺部感染mNGS檢測的最佳標(biāo)本。

4.局限性與展望

mNGS在病原體檢測方面具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，尤其對于混合感染具有絕對優(yōu)勢，但仍然存在一些需改進(jìn)的問題。第一，mNGS技術(shù)本身缺乏行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，部分商家受利益驅(qū)動縮小測試數(shù)據(jù)量至1M～5M，從而可能出現(xiàn)結(jié)果的假陰性。第二，mNGS技術(shù)在文庫制備及病原體識別方面缺乏統(tǒng)一、全面、準(zhǔn)確的參照數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)致不同檢測機構(gòu)的結(jié)果可能會有差別，也沒有統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。第三，mNGS結(jié)果判讀缺乏學(xué)術(shù)界公認(rèn)的指南或?qū)＜夜沧R，臨床醫(yī)生對于結(jié)果判讀依靠臨床經(jīng)驗，有望隨著研究的進(jìn)一步深入，形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。第四，標(biāo)本中人源性背景核酸干擾mNGS結(jié)果,去人源化技術(shù)有待進(jìn)一步提高。本文通過對現(xiàn)有的研究進(jìn)行總結(jié)歸納，為臨床醫(yī)生進(jìn)行mNGS結(jié)果判讀及標(biāo)本選擇提供參考意見。