高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性中的應(yīng)用價(jià)值

白塔吉，何金英，馬玉珍

輔助生殖技術(shù)應(yīng)用于人類(lèi)已有近40年的歷史，是不孕不育患者最有效的治療方法之一。隨著超促排卵方案的優(yōu)化和體外受精（in vitro fertilization，IVF）、胚胎培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)，胚胎質(zhì)量顯著提高，但是經(jīng)過(guò)IVF-胚胎移植（embroyo transfer，ET）技術(shù)助孕的活產(chǎn)率依然是30%～40%，胚胎植入仍然是其成功的限速步驟[1]。

子宮是所有胎生雌性動(dòng)物必備的重要生殖器官，是胚胎著床以及發(fā)育的“土壤”，在胎生動(dòng)物繁衍后代的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。育齡期女性在月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜分為月經(jīng)期、增殖期和分泌期，1956年世界衛(wèi)生組織（WHO）首次提出月經(jīng)周期的分泌中期（第19～23天）為子宮內(nèi)膜容受期，在這一時(shí)期，進(jìn)入子宮的囊胚黏附、侵入并誘導(dǎo)內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生一系列變化，最終植入內(nèi)膜發(fā)育形成胎兒，通常將子宮內(nèi)膜的這一時(shí)期稱(chēng)為胚胎植入窗口期[2]。近10年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將基因表達(dá)與子宮內(nèi)膜組織形態(tài)、細(xì)胞性質(zhì)相聯(lián)系，月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜基因差異表達(dá)的研究通過(guò)差異基因表達(dá)譜[3-5]得到與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的基因，并將其制定成特有的子宮內(nèi)膜容受性微陣列（endometrial receptive microarrays，ERA），能夠更加精準(zhǔn)地確定個(gè)體間子宮內(nèi)膜容受期。與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因表達(dá)的研究較多，但研究結(jié)果中基因重疊性較低，可能與樣本量小、樣本可變性和測(cè)序技術(shù)的局限性相關(guān)。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（high-throughput transcriptome sequencing）是一種強(qiáng)大的基于核苷酸測(cè)序的方法，無(wú)需預(yù)先針對(duì)已知序列設(shè)計(jì)探針，即可對(duì)任何生物整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，因此應(yīng)用范圍更加廣泛。近年來(lái)表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的大量研究證實(shí)，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不僅可以量化月經(jīng)不同時(shí)期子宮內(nèi)膜基因表達(dá)水平的變化、了解基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，還可以發(fā)現(xiàn)和鑒定子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)的生物標(biāo)志物[6]。

1 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing technology） 是相對(duì)于傳統(tǒng)的桑格測(cè)序（Sanger sequencing）而言的。高通量測(cè)序可以大規(guī)模、高通量、高速度、高自動(dòng)化地對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行研究，并且具有完美的定量功能和低廉的成本，從而克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)復(fù)雜、低效等缺陷。該技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)?；蚪M測(cè)序，還可用于基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA的鑒定、轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選和DNA甲基化等相關(guān)研究。因此，基因組測(cè)序技術(shù)在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷、治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。

轉(zhuǎn)錄組是揭示細(xì)胞及組織中分子組成和解讀基因組功能所必需的。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)不僅能夠在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)、分析和量化RNA表達(dá)水平，而且還可以分析非編碼RNA序列，結(jié)合生物信息學(xué)可以更加全面地了解基因表達(dá)水平和調(diào)控機(jī)制[8]。

2 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在子宮內(nèi)膜容受性中的應(yīng)用

2.1 可育女性子宮內(nèi)膜容受期的基因表達(dá) 子宮內(nèi)膜受甾體激素調(diào)節(jié)發(fā)生增殖、分化和脫落周期性變化，雖然子宮內(nèi)膜容受性在過(guò)去幾十年中已被廣泛研究，但其具體分子機(jī)制仍不清楚。目前利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)尋找與子宮內(nèi)膜容受期相關(guān)的基因表達(dá)已有許多報(bào)道。Altm?e等[9]首次對(duì)人類(lèi)胚胎（n=128）和人類(lèi)子宮內(nèi)膜（n=8）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)合基因功能注釋及富集分析發(fā)現(xiàn)，整合素、層黏連蛋白、膠原蛋白等細(xì)胞黏附分子和炎癥反應(yīng)途徑、JAK-STAT信號(hào)通路在植入過(guò)程中的重要性。還確定了涉及植入過(guò)程的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體途徑，其中骨橋蛋白、白血病抑制因子（LIF）和瘦素途徑具有互作調(diào)控機(jī)制。此外，研究還發(fā)現(xiàn)胚胎-子宮內(nèi)膜相互作用中的許多新蛋白，如載脂蛋白D（APOD）、內(nèi)皮素1（END1）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7（FGF7）和胃泌素（GAST）等。Hu等[10]通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜容受期有2 372個(gè)基因差異表達(dá)，其中1 099個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 273個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）對(duì)其中19個(gè)基因進(jìn)行了符合性驗(yàn)證；利用生物信息學(xué)對(duì)基因功能進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白（MT）家族7個(gè)成員（MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M、MT1X和MT2A）以及與子宮內(nèi)膜生理學(xué)相關(guān)的4種新型轉(zhuǎn)錄物（HAP1、ZCCHC12、MRAP2和OVGP1）在胚胎植入過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與上調(diào)的礦物質(zhì)吸收富集途徑和下調(diào)的細(xì)胞周期富集途徑相關(guān)。同時(shí)揭示了5種調(diào)節(jié)因子GLI2、CDC25A、Toll樣受體9（Toll like receptor 9，TLR9）、MT1G和SLC5A1與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)。Altm?e等[11]在子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組生物標(biāo)志物薈萃分析中發(fā)現(xiàn)57個(gè)差異表達(dá)的基因和調(diào)控其功能的348個(gè)微小RNA（miRNA），主要通過(guò)免疫應(yīng)答反應(yīng)、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)和外泌體途徑在調(diào)控子宮內(nèi)膜容受期中發(fā)揮作用。Rekker等[12]對(duì)可育女性容受前期與容受期子宮內(nèi)膜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩者存在91個(gè)差異表達(dá)的miRNA和865個(gè)差異表達(dá)的mRNA，發(fā)現(xiàn)這865個(gè)目標(biāo)mRNA參與了子宮內(nèi)膜容受期經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，根據(jù)功能評(píng)分觀察到這些mRNA在糖皮質(zhì)激素、G蛋白耦聯(lián)受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）和JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑中顯著上調(diào)，而在Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)傳導(dǎo)途徑中顯著下調(diào)。目前研究已經(jīng)確定了許多與胚胎植入相關(guān)的生物標(biāo)志物，包括LIF、骨橋蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（IGFBP-1）、人透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白2（HABP2）、肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（HB-EGF）、白細(xì)胞介素15（IL-15）、孕激素相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白（PAEP）、同源盒基因A10（HOXA10）、空通氣孔同源框2（EMX2）、黏蛋白1（MUC1）和集落刺激因子1（CSF-1）等。

2.2 反復(fù)植入失?。≧IF）患者子宮內(nèi)膜基因表達(dá) 利用輔助生殖技術(shù)治療不孕癥的過(guò)程中，部分患者通過(guò)IVF獲得優(yōu)質(zhì)胚胎，但是移植后出現(xiàn)胚胎RIF現(xiàn)象。導(dǎo)致RIF的因素包括配子/胚胎因素、子宮因素、免疫因素和血栓形成等，但RIF的確切機(jī)制目前仍不明確，已知子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化異常是導(dǎo)致RIF的重要原因之一。子宮內(nèi)膜在雌、孕激素及趨化因子介導(dǎo)下發(fā)生蛻膜化，蛻膜化的子宮內(nèi)膜通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、黏附因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及趨化因子等，為接受胚胎及介導(dǎo)植入做好充分的準(zhǔn)備。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)黏附因子在RIF患者容受期子宮內(nèi)膜樣本中異常表達(dá)，抑制基質(zhì)細(xì)胞分化、阻礙蛻膜化進(jìn)程，從而影響胚胎植入[13-15]。細(xì)胞因子及其受體相互作用通路在早期胚胎的發(fā)育和植入過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。RIF患者子宮內(nèi)膜中有許多mRNA表達(dá)異常，其中表達(dá)下調(diào)的多數(shù)mRNA都涉及細(xì)胞因子及其受體相互作用通路[16]。但這些圍繞蛋白編碼基因的功能研究，不足以解釋子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的復(fù)雜變化和周期差異。張倩[17]通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選8例RIF患者與10例行IVF的非RIF女性容受期子宮內(nèi)膜組織中差異表達(dá)的miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）和mRNA，共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 157個(gè)（97個(gè)上調(diào)、60個(gè)下調(diào)），lncRNA 1 292個(gè)（679個(gè)上調(diào)、613個(gè)下調(diào)），mRNA 294個(gè)（152個(gè)上調(diào)、142個(gè)下調(diào)）。并證實(shí)RIF患者容受期子宮內(nèi)膜組織中顯著上調(diào)的miR-148a-3p和lincARDD1，進(jìn)一步說(shuō)明miR-148a-3p可能通過(guò)下調(diào)HOXC8抑制基質(zhì)細(xì)胞分化，阻礙蛻膜化進(jìn)程，從而影響胚胎植入，導(dǎo)致胚胎種植失敗。而lincARDD1調(diào)控的靶基因CSF-1在RIF患者容受期內(nèi)膜組織中表達(dá)上調(diào)，造成蛻膜化反應(yīng)異常，從而導(dǎo)致胚胎種植失敗。

3 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在子宮內(nèi)膜容受性的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制

3.1 miRNA 其作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，由于序列短、同源性高，利用基因芯片檢測(cè)miRNA非常困難，高通量測(cè)序技術(shù)不但能夠克服這一難題，而且能夠發(fā)現(xiàn)新的miRNA。miRNA在多種生物學(xué)過(guò)程中具有調(diào)控作用，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡以及胚胎發(fā)育和著床[18]。許多研究通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-30b、miR-30d、miR-494和miR-923在子宮內(nèi)膜容受期特異表達(dá)，認(rèn)為其與胚胎著床密切相關(guān)。miR-30b和miR-30d在容受期子宮內(nèi)膜中顯著上調(diào)，而miR-494和miR-923下調(diào)，這些差異表達(dá)的miRNA調(diào)控子宮內(nèi)膜基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和凋亡等過(guò)程，并主要參與Wnt/β-catenin、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、p53和細(xì)胞黏附分子等與胚胎植入相關(guān)的途徑[19]。Rekker等[12]比較了RIF患者和可育女性容受期子宮內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的21種miRNA和14種mRNA，證實(shí)了miR-30和miR-200家族成員在容受期子宮內(nèi)膜組織中特異表達(dá)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)18種新的miRNA，其中miR-424-5p通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附因子、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期途徑在RIF子宮內(nèi)膜中顯著上調(diào)。Liang等[20]從多個(gè)方面討論了miRNA對(duì)胚胎植入的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)miRNA不僅在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用，由于miRNA在生物環(huán)境中具有高度穩(wěn)定性，并可以由子宮內(nèi)膜和胚胎分泌到細(xì)胞外環(huán)境，從而促進(jìn)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。該研究在人類(lèi)IVF失敗的胚胎培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)較高水平的miR-191，提示miR-191可能作為胚胎植入失敗的生物標(biāo)志物。研究還通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與其分泌的外泌體中的miRNA圖譜，發(fā)現(xiàn)13個(gè)miRNA（hsamiR-200c、hsa-miR-17和hsa-miR-106a等） 在外泌體中特異表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)這13個(gè)外泌體miRNA調(diào)控的靶基因參與了多個(gè)與胚胎植入相關(guān)的信號(hào)通路。該研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外miRNA的功能為胚胎植入研究提供了新思路。而且，miRNA可以作為非侵入性生物標(biāo)志物評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性，從而提高輔助生殖技術(shù)的妊娠結(jié)局。

3.2 lncRNA 其是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色體修飾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)确矫婢哂兄匾δ?。迄今為止，已?jīng)通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定了越來(lái)越多的lncRNA。由于一些lncRNA在外周血中保持穩(wěn)定，并受到內(nèi)源性RNA酶保護(hù)，因此可以作為臨床診斷和檢測(cè)的生物標(biāo)志物[21]。Sigurgeirsson等[22]應(yīng)用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)7例可育女性非容受期與容受期子宮內(nèi)膜行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)516個(gè)lncRNA差異表達(dá)，其中177個(gè)lncRNA在非容受期表達(dá)較高，339個(gè)lncRNA在容受期表達(dá)較高。Chen等[23]通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)3例RIF患者與3例供精人工授精患者容受期子宮內(nèi)膜組織的lncRNA表達(dá)模式進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)742個(gè)差異表達(dá)的lncRNA和460個(gè)差異表達(dá)的mRNA。選擇與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的功能評(píng)分最高的10個(gè)lncRNA和6個(gè)mRNA通過(guò)qRTPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果一致。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的lncRNA通過(guò)腫瘤壞死因子（TNF）、TLR、核因子κB（NF-κB）和B細(xì)胞受體（BCR）信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及破骨細(xì)胞分化途徑、脂肪酸分解代謝和醚脂質(zhì)新陳代謝途徑調(diào)節(jié)靶基因聚集，其中TLR和BCR信號(hào)傳導(dǎo)途徑是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵途徑。該研究為lncRNA調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。Xu等[24]通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較5例RIF患者和5例可育女性容受期子宮內(nèi)膜樣本的RNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)1 508個(gè)mRNA、169個(gè)lncRNA和86個(gè)miRNA差異表達(dá)；對(duì)相關(guān)lncRNA進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)TRG-AS1、SIMM25、NEAT1、LNC00511、SLC26A4-AS1和H19的差異表達(dá)主要富集于免疫反應(yīng)、炎癥過(guò)程、代謝過(guò)程及細(xì)胞周期途徑。并且提出了競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)假說(shuō)，揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制，認(rèn)為miRNA可以通過(guò)結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默，ceRNA可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，而lncRNA可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性并參與ceRNA假說(shuō)。Feng等[25]構(gòu)建了與RIF相關(guān)的lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（IFLMN），經(jīng)過(guò)拓?fù)浞治?、聚?lèi)分析及共表達(dá)分析篩選出IFLMN中6個(gè)關(guān)鍵lncRNA（NONHSAT083203、NONHSAT212577、NONHSAT035952.2、NONHSAT 193031.1、NONHSAT053761.2和NONHSAT025064.2）及其ceRNA子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其涉及免疫活性、生長(zhǎng)因子結(jié)合、血管增生、細(xì)胞凋亡以及子宮內(nèi)膜胚胎植入前激素的生物合成過(guò)程，提示這6個(gè)lncRNA可能成為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的生物標(biāo)志物。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

多個(gè)基因數(shù)據(jù)庫(kù)信息顯示，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)25%的RIF患者存在子宮內(nèi)膜植入窗移位[26]。也有研究表明，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)RIF的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)100%[27]。但高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)指導(dǎo)RIF患者個(gè)性化胚胎移植（personal embryo transfer，pET） 的相關(guān)報(bào)道甚少，部分研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議，還需要開(kāi)展大量研究證實(shí)。相信隨著研究的不斷深入，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在子宮內(nèi)膜容受性以及胚胎植入領(lǐng)域中的作用必將越來(lái)越清晰，在人類(lèi)不孕不育的診斷和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。