囊狀幼蟲病的流行與發(fā)展

張南 陳恒 趙灤 藺哲廣 吉挺

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

1 前言

病毒嚴(yán)重危害蜜蜂健康。自1913年首次在蜜蜂中分離出第一個(gè)病毒后，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過20 種蜜蜂病毒[1]，其中常見的七種病毒分別為：蜜蜂殘翅病毒（DWV）、以色列急性麻痹病毒（IAPV）、急性蜜蜂麻痹病毒（ABPV）、慢性蜜蜂麻痹病毒（CBPV）、黑蜂王臺(tái)病毒（BQCV）、蜜蜂囊狀幼蟲病病毒（SBV）、克什米爾病毒（KBV）。囊狀幼蟲病毒的傳播范圍較廣[2]，目前英國、澳大利亞、印度、丹麥、南非、尼泊爾及中國等國家均有報(bào)道[3]。1972年在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂幼蟲感染囊狀幼蟲病毒[4]，隨后SBV 便向中國大部分地區(qū)蔓延，引起成片的幼蟲死亡，導(dǎo)致中華蜜蜂蜂群數(shù)量急劇下降。由于蜜蜂生存環(huán)境的溫度較高且比較擁擠，一旦出現(xiàn)病毒攜帶者，會(huì)造成病毒的快速傳播，感染病毒的蜜蜂將會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、組織損傷以及靶基因功能紊亂[5]。我們對近年來有關(guān)囊狀幼蟲病的研究報(bào)道進(jìn)行綜述，旨在為囊狀幼蟲病的防治提供新的見解。

2 SBV簡述

2．1 SBV的結(jié)構(gòu)

SBV 屬于傳染性軟腐病病毒科（Iflaviridae），具有大約9000～11000 堿基的單股正鏈RNA 基因組。最常見的感染途徑是攝入被病毒污染的食物，感染過程很快，一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞，幾小時(shí)內(nèi)就能產(chǎn)生子代病毒[6]。SBV 編碼一個(gè)大的開放閱讀框，結(jié)構(gòu)蛋白位于5’端，VP1、VP2 和VP3 形成其衣殼，其中VP1 氨基酸序列為高變區(qū)，序列的差異可能揭示了不同病毒之間不同的病毒活性；RdRp、3C 非結(jié)構(gòu)蛋白位于3’端，RdRp 具有高度保守型[7]。SBV 一般指從西方蜜蜂病群內(nèi)分離出的，而從東方蜜蜂群內(nèi)分離出的SBV 變異菌株稱中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒（CSBV），與SBV 具有不同的抗原性[8]。史紅霞等[9]研究證明RdRp 可作為CSBV 的RNA 干擾治療的靶基因。

隨著不斷的研究，發(fā)現(xiàn)SBV 病毒多樣性的增加。由于SBV 為正鏈RNA 病毒，其復(fù)制時(shí)沒有校對機(jī)制，導(dǎo)致SBV 在宿主體內(nèi)很容易發(fā)生變異，發(fā)展成具有不同侵染力及不同毒性的菌株。有學(xué)者認(rèn)為SBV 和CSBV 為不同的血清型[10]且兩種血清型都能分別對東方蜜蜂蜂群和西方蜜蜂蜂群感染，特別的是，兩種血清型各有9 個(gè)特異性保守氨基酸序列。在自然選擇和免疫壓力下，SBV 和CSBV 可能在宿主之間進(jìn)行交換，表明這些病毒是獨(dú)立進(jìn)化的[11]。CSBV 可以導(dǎo)致西方蜜蜂的死亡[12]，同時(shí)從西方蜜蜂中分離出的SBV 也能跨越物種屏障感染東方蜜蜂[13]。下文所述及SBV 除明確指出外，均包括感染西方蜜蜂的SBV 和感染東方蜜蜂的CSBV。

2．2 SBV的流行規(guī)律

SBV 主要感染蜜蜂幼蟲階段，并表現(xiàn)出較高的流行率，患病初期，工蜂辨別出幼蟲在封蓋子脾中死亡后，隨即將房蓋咬開，清理因病死亡的幼蟲，蜂王繼續(xù)在幼蟲脾中產(chǎn)卵，形成卵、蟲、蛹、空房相間的“花子”現(xiàn)象[14]。隨著患病的幼蟲增多，工蜂來不及清除，未能清除的患病幼蟲軀體變軟，顏色由白色晶亮逐漸變黃、黃褐色，直至變成黑褐色龍舟狀鱗片。死亡的幼蟲頭尖上翹，呈尖頭狀，蟲體呈下粗上細(xì)，含有SBV的液體在未脫落的外表皮與蟲體間積累，感染的幼蟲從巢房中取出呈囊袋狀，尸液無臭味，死亡幼蟲在脾上成片分布[15]。1～2日齡幼蟲易染病，5～6日齡預(yù)蛹期死亡率較高。病情嚴(yán)重時(shí)，染病蜂場會(huì)出現(xiàn)幾箱蜂甚至十幾箱蜂群一起離開巢箱掛在樹上的現(xiàn)象[16]。由于高溫下病毒的蛋白質(zhì)易失活，低溫下病毒保持穩(wěn)定。所以SBV 多發(fā)生于春季（3～5月）及晚秋至初冬（10～11月），寒潮頻繁、氣溫變化劇烈的時(shí)期，夏季高溫時(shí)病情消失。

2．3 SBV的傳播途徑

病毒的傳播通常分為水平傳播和垂直傳播兩種途徑。垂直傳播又稱為縱向傳播，指病毒從成年個(gè)體傳播給其后代。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)[17]，在感染病毒的蜂群中，盡管蜂王未表現(xiàn)出病毒感染的病理癥狀，但在其糞便或任何解剖組織中仍可檢測出SBV，感染病毒蜂王所產(chǎn)的卵檢測出了病毒，證明SBV 可以通過親代垂直傳播給子代。

蜂群中的水平傳播是SBV 的一種主要傳播方式。水平傳播又稱為橫向傳播是指病毒在同代個(gè)體之間傳播，包括食源、交尾及媒介三種傳播方式。成年工蜂是造成病毒通過食源傳播的主要傳播者，隱性感染的成蜂飼喂健康幼蟲時(shí)將病毒傳染給健康的幼蟲及采蜜采粉或迷巢將病毒傳播給其他蜂群；雄蜂感染SBV 后與蜂王交尾，使蜂王感染SBV[18]；體外寄生的螨可能在SBV 傳播中起著重要作用[19]。

SBV 可以感染各個(gè)階段的蜜蜂且在宿主中可存活4 周[20]。由于成年工蜂的衛(wèi)生學(xué)行為，清理染病幼蟲時(shí)可能感染SBV，從而成為病毒攜帶者。SBV 對成年工蜂造成的危害主要體現(xiàn)在兩方面，一方面SBV 可能縮短成年工蜂的壽命[21]；另一方面可能會(huì)造成蜜蜂種群在經(jīng)濟(jì)上的重大損失。新西蘭的研究表明，感染了SBV 的成年工蜂，在采集花蜜時(shí)可能會(huì)對農(nóng)作物授粉產(chǎn)生不利的影響，特別是在初夏開花且只產(chǎn)生花粉的植物[22]。成年工蜂在蜂群中擔(dān)任著哺育、衛(wèi)生、采集等工作，哺育染病幼蟲或清理因病死亡的幼蟲后，SBV會(huì)在下顎腺積累[23]。由此可見，無癥狀感染的成年工蜂同樣會(huì)引起SBV 在蜂群中的傳播。

2．4 檢測方法

在疾病爆發(fā)前準(zhǔn)確、快速地檢測出病毒，有助于將感染的蜂群與健康的蜂群隔離。雖然可根據(jù)出現(xiàn)的典型癥狀判斷，然而出現(xiàn)特征癥狀時(shí)已錯(cuò)過了最佳時(shí)期。與傳統(tǒng)的血清學(xué)方法相比，更多學(xué)者選擇采用分子學(xué)實(shí)驗(yàn)方法檢測病毒。

RT-PCR 技術(shù)為目前報(bào)道出來的診斷囊狀幼蟲病毒方法之一，Yan X 等[24]首次用RT-PCR 方法檢測CSBV，Pair2 引物適用于無任何癥狀的感染幼蟲和成年工蜂的CSBV 檢測；張明華等[25]選擇結(jié)構(gòu)蛋白VP3 基因?yàn)榘谢?，根?jù)GenBank中序列合成1對特異性引物。RT-PCR 法具有快速、可靠、重現(xiàn)性好、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，其原理為根據(jù)一段序列設(shè)計(jì)特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增，然而SBV 的多樣性導(dǎo)致基因組不同區(qū)域檢出率差異較大[26]。

酶聯(lián)免疫測定法具有很高的特異性，Li Ming 等[7]建立以VP2 蛋白為靶抗原制備單克隆抗體ELISA，不能與其他蜜蜂病毒發(fā)生反應(yīng)，僅能與CSBV 發(fā)生反應(yīng)。此法易于標(biāo)準(zhǔn)化、批量生產(chǎn)、適用于大量臨床樣本檢測。

3 SBV感染對東、西方蜜蜂的影響

蜜蜂感染SBV 后，為調(diào)整病毒侵染帶來的影響，機(jī)體會(huì)及時(shí)做出營養(yǎng)代謝及免疫方面的反應(yīng)。工蜂特有的衛(wèi)生行為，能快速清除感染SBV 的病死蜂；腸道環(huán)境形成的化學(xué)屏障可抑制病原體繁殖和擴(kuò)散[12]。然而這種應(yīng)對機(jī)制并不足以抵消SBV 造成的幼蟲死亡及成蜂壽命減短。東方蜜蜂和西方蜜蜂為目前全世界飼養(yǎng)的主要蜂種，在長期的進(jìn)化過程中，蜜蜂進(jìn)化出了獨(dú)特的免疫系統(tǒng)和免疫機(jī)制。在東方蜜蜂和西方蜜蜂發(fā)育的不同階段，其響應(yīng)SBV 脅迫的免疫應(yīng)答也不同。

4日齡東方蜜蜂幼蟲感染SBV，免疫相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)且可能影響幼蟲的營養(yǎng)代謝，研究表明[27]幼蟲感染CSBV，體內(nèi)18 種碳水化合物和能量代謝相關(guān)蛋白下調(diào)，甚至其中8 種下降10 倍。西方蜜蜂幼蟲應(yīng)對SBV 侵染的方式完全不同，西方蜜蜂4日齡幼蟲感染SBV，機(jī)體的營養(yǎng)代謝相關(guān)基因顯著上調(diào)，而免疫相關(guān)基因顯著下調(diào)。碳水化合物是蜜蜂幼蟲快速生長的主要能量來源[28]，東方蜜蜂幼蟲為了提高自身免疫能力，以消耗營養(yǎng)儲(chǔ)備為代價(jià)。相反，西方蜜蜂幼蟲感染病毒后，為保證早期生長及化蛹變態(tài)期的營養(yǎng)物質(zhì)需要，機(jī)體提高了營養(yǎng)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。

在蛹期發(fā)育階段，東方蜜蜂感染SBV 后抗病毒基因及凋亡相關(guān)基因會(huì)顯著上調(diào)，同時(shí)體內(nèi)的4 種角質(zhì)層蛋白下調(diào)近10 倍[27]。西方蜜蜂蛹期檢測到免疫基因及凋亡基因均顯著性下調(diào)。蜜蜂在蛹期要經(jīng)歷大部分器官和組織重塑，與發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)在此過程中起著至關(guān)重要的作用[29]。蛹期的蟲體表皮已形成并被包裹在角質(zhì)層中，病毒侵染會(huì)導(dǎo)致凋亡基因的過度表達(dá)及角質(zhì)蛋白顯著下降，這可能是造成幼蟲化蛹失敗甚至死亡的原因。西方蜜蜂在蛹期得以生存甚至成功化蛹的原因可能是增強(qiáng)了自身的免疫機(jī)能。

20日齡東方蜜蜂采集蜂感染SBV，一般的免疫基因沒有顯著變化，僅hex110、vg、toll營養(yǎng)代謝基因顯著下調(diào)，且體內(nèi)與病毒降解相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。西方蜜蜂20日齡蜜蜂體內(nèi)與RNAi 抗病毒機(jī)制相關(guān)的ago基因顯著降低。成年蜜蜂感染SBV 對其營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)方面造成一定影響，引起成年采集蜂的壽命減短[30]。

感染SBV 會(huì)引起細(xì)胞凋亡、組織損傷甚至機(jī)體的功能紊亂，這些變化都在蛋白質(zhì)組的改變上進(jìn)一步體現(xiàn)。健康蜜蜂幼蟲需要大量蛋白質(zhì)以滿足正常發(fā)育和代謝[20]，蛋白質(zhì)磷酸化作為最常見的翻譯后修飾之一，幾乎參與了細(xì)胞代謝的所有方面[31]。Han B 等研究數(shù)據(jù)[27]表明，SBV 感染促發(fā)了幼蟲必需蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的變化，通過破壞能量供應(yīng)、蛋白質(zhì)的生物合成、激素調(diào)節(jié)、抗氧化防御等途徑，造成幼蟲死亡。因此，蛋白質(zhì)組及磷酸化蛋白質(zhì)組的改變可能影響蜜蜂健康。

4 防治措施

4．1 預(yù)防

目前暫無囊狀幼蟲病的特異性治療藥物，因此在生產(chǎn)中提倡以預(yù)防為主、治療為輔的原則。囊狀幼蟲病的發(fā)病季節(jié)與氣候、蜜源及蜜蜂品種都有關(guān)[32]，所以在做預(yù)防工作時(shí)要針對這些誘病因素進(jìn)行綜合考慮。在氣溫變化劇烈時(shí)期需注重蜂群的飼養(yǎng)管理，科學(xué)的飼養(yǎng)水平可以有效預(yù)防囊狀幼蟲病的發(fā)生，其實(shí)質(zhì)就是提高蜂群的抗病力。保持蜂多于脾，將蜂群放置在環(huán)境干燥、通風(fēng)、向陽的偏僻靜處飼養(yǎng)，減少驚擾可有效減少蜂群得病率。保證蜂群充足、優(yōu)質(zhì)的飼料，蜜蜂的營養(yǎng)充足，生長發(fā)育好，則抗病力強(qiáng)。

蜂群的抗病性與發(fā)病率有很大關(guān)系，一些群勢較強(qiáng)的蜂群因抗病性弱也會(huì)發(fā)病，在生產(chǎn)過程中需堅(jiān)持長期選擇抗病力、繁殖力、生產(chǎn)力好的蜂群作為父母群選育，獲得抗囊狀幼蟲病的蜂群。任勤等[33]基于蜜蜂的衛(wèi)生行為，通過液氮冷凍法選育出具有衛(wèi)生行為的中華蜜蜂蜂群，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病率及發(fā)病程度明顯低于對照組，選育的工蜂能及時(shí)將感染的幼蟲清除，更好地執(zhí)行了衛(wèi)生行為。

4．2 治療

蜂群感染SBV 時(shí)，可根據(jù)典型的病癥結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測診斷。初步診斷時(shí)要注意囊狀幼蟲病與歐洲幼蟲腐臭病的區(qū)別，避免誤診造成用錯(cuò)藥。歐洲幼蟲腐臭病多發(fā)生于較弱的蜂群，感染的幼蟲死亡發(fā)生在封蓋前，工蜂無需打開房蓋，一般在封蓋子脾上沒有細(xì)小的穿孔。死亡的幼蟲在巢房內(nèi)呈C 字形，軀體呈乳白、灰白、黃白色，呈不規(guī)律的散點(diǎn)狀分布，嚴(yán)重時(shí)也有成片的[34]。

一旦發(fā)現(xiàn)囊狀幼蟲病，不論病情輕重，需立即搬遷隔離，將染病蜂群與健康蜂群隔離，避免病毒的持續(xù)蔓延。對隔離的染病蜂群采取縮脾緊脾、扣王斷子清剿等措施，再從健康群或抗病群中移蟲，人工育王或用它們產(chǎn)生的自然王臺(tái)給病群換王。

目前藥物治療分為西藥和中藥兩種渠道，西藥治療方法為使用適量的抗病毒一號[35]，但使用抗病毒藥物后蜂產(chǎn)品中可能會(huì)有殘留。中藥的優(yōu)點(diǎn)為有效成分不易散失及副作用小，目前中藥治療SBV 的研究正在成為新熱點(diǎn)。蜂農(nóng)康中山[36]使用本地尖刀草陰干后放于蜂箱上治療SBV 有一定的治療效果；貫眾、板藍(lán)根、金銀花等中草藥具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，目前作用于SBV 治療上研究相對較多[2,37]。鑒于囊狀幼蟲病毒可以跨越物種屏障感染且對蜂群具有較嚴(yán)重的危害，在生產(chǎn)實(shí)踐中，蜂農(nóng)應(yīng)該學(xué)會(huì)及早識別蜜蜂疾病，做到早發(fā)現(xiàn)，早防治。