小反芻獸疫診斷方法研究進(jìn)展

肖 敏，張 梅#

（甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046）

小反芻獸疫（Peste des petits nuninants，PPR）曾被稱為羊瘟（Goat plague）、小反芻獸瘟（Pest of small ruminants）、肺腸炎或口炎—肺腸炎復(fù)合癥或綜合征（Pneumonia-enteritis or stomatitis-pneumoenteritis complex or syndrome）、偽牛瘟（Pseudo-rinderpest）和卡他（Kata）等，是山羊、綿羊及野生小反芻獸感染小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）后引起的一種以高熱稽留、眼鼻分泌物增多、口腔糜爛、肺炎和腹瀉為特征的急性接觸性傳染病[1～2]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的疫病，各國無疫狀態(tài)需要經(jīng)過OIE的官方認(rèn)證，我國將其列為一類動物疫病。在該疫情發(fā)生時，山羊的發(fā)病率幾乎達(dá)到100%，死亡率高達(dá)20%～90%，嚴(yán)重暴發(fā)時死亡率甚至高達(dá)100%[3～4]。

自1942年，法國首次正式報道小反芻獸疫發(fā)生于西非的科特迪瓦（原名象牙海岸）以來，隨后非洲的一些國家（如尼日利亞和烏干達(dá)等）相繼發(fā)生。近年來，該病逐漸蔓延至中東、西亞及南亞各國，我國周邊的國家和地區(qū)亦呈地方性流行，對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，由此帶來的國際貿(mào)易限制將會造成進(jìn)一步的經(jīng)濟(jì)損失。2007年7月26日，我國西藏自治區(qū)日土縣首次發(fā)生小反芻獸疫疫情，隨后幾年，疫情僅限于西藏地區(qū)[5]。2013年底，新疆暴發(fā)小反芻獸疫疫情，并蔓延至國內(nèi)其他省、市及自治區(qū)，作為一種重大的動物疫病，已嚴(yán)重威脅著我國的動物衛(wèi)生安全和養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，2021年我國新疆、青海、西藏等省份相繼發(fā)生小反芻獸疫，給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

1 病原特征

PPRV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬的成員，是具有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒。從3′端至5′端依次為N-P-M-F-H-L 6個基因，其基因組大小為15 948 bp，遵循六堿基原則[6]。基因組3’末端為基因組啟動子，5’末端為反基因組啟動子。每2個基因之間存在基因間隔區(qū)，分別編碼病毒6種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白。PPRV病毒粒子呈多形性，大多呈圓形或橢圓形，直徑約為400～500 nm，電鏡下可見病毒粒子的囊膜上有2種糖蛋白纖突，長度約8.5～14.5 nm，由融合蛋白和血凝素蛋白構(gòu)成。

小反芻獸疫病毒粒子在pH值偏中性時穩(wěn)定，過酸過堿均可使其失活，非離子去垢劑能將囊膜表面的纖突脫落，從而降低病毒的感染力。大多數(shù)化學(xué)滅活劑都可將其滅活，如2%的NaOH等。在紫外線和光照等自然條件下均可使其失去活力，50 ℃置于30 min可使其喪失感染力。

2 診斷方法研究進(jìn)展

2.1 初步診斷

可通過臨床觀察、特征性癥狀、流行病學(xué)、死后剖檢病變可做出初步診斷。

2.2 實(shí)驗室診斷

2.2.1 樣品采集

棉拭子樣品：對于活畜，用棉拭子采集發(fā)病羊的眼結(jié)膜分泌物、鼻分泌物、口腔刮取物及肛門排泄物。全血樣品：在發(fā)病早期，采集全血加入抗凝劑，必要時加入抗生素抑制細(xì)菌生長。組織樣品：采集一些有典型病變的組織樣品，如腸系膜、支氣管淋巴結(jié)以及肺臟、脾臟、扁桃體等器官組織。各種樣品的保存條件如下：血清應(yīng)置于-20 ℃長期保存；棉拭子樣品、組織病料應(yīng)置于-80 ℃保存；組織病理樣品不能冷凍，可在福爾馬林溶液中室溫保存。

2.2.2 病毒的分離

PPRV能在牛和羊的原代細(xì)胞中分離和培養(yǎng)，一般病毒在接種后10～30 min為吸附期，在第2～6小時是隱蔽器，自第24 小時直到第7 天病毒以出芽方式生出。當(dāng)多核細(xì)胞出現(xiàn)芽生時即停止。細(xì)胞在接種病毒后的第6～15天出現(xiàn)病變，呈“鐘表盤”。病變的特點(diǎn)是出現(xiàn)多核細(xì)胞，細(xì)胞中央為一團(tuán)細(xì)胞質(zhì)，周圍有一個折光環(huán)，細(xì)胞核內(nèi)有嗜酸性包涵體（1～6個），周圍有一較亮的暈環(huán)。

2.2.3 病毒抗原的檢測

（1）瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗：樣品可以選擇口鼻分泌物、眼分泌物、肛門排泄物和組織病料，以進(jìn)行病毒抗原的檢測，而不必使用動物死后剖檢病料。但是，該方法的敏感性有限，而且所需時間相對較長，因此使用受到限制。

（2）對流免疫電泳：Majiyagbe于1984年建立了該方法。是最快的病毒抗炎檢測方法。通過對比AGID和CIEP可以明顯觀察到，CIEP的敏感性要顯著高于前者，并且有的樣品最短在30 min就可以觀察到結(jié)果。

（3）免疫組織化學(xué)：Kumar等研究了強(qiáng)毒株P(guān)PRV實(shí)驗感染山羊后的致病性并應(yīng)用免疫組化方法對病毒分布進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示病毒分離株（PPR/Izatnagar/94）具有高毒力，能引起山羊100%死亡率，在特定器官中，如肺臟、腸和淋巴組織中具有特征性病理變化。

（4）血凝試驗：根據(jù)報道，PPRV具有血凝活性，根據(jù)這一特點(diǎn)有研究者建立了特異性、快速和廉價的血凝試驗診斷方法。因為牛瘟病毒不能凝集紅細(xì)胞，因此HA還能區(qū)分PPRV和RPV。

2.2.4 病毒核酸的檢測

（1）核酸雜交技術(shù)：利用針對N基因的32P標(biāo)記cDNA探針，可用于小反芻獸疫和牛瘟的鑒別診斷。但是該方法又有一定的缺陷，如32P半衰期短（14 d）、對樣品新鮮要求程度高，以及需要特殊防護(hù)裝備，現(xiàn)已基本不用。后來又有使用生物素或地高辛標(biāo)記的探針鑒別診斷PPRV和RPV，該方法非常特異、快速，但靈敏性較使用放射性探針較低。

（2）RT-PCR：RT-PCR的靈敏度是常規(guī)病毒分離的1 000倍，可以在5 h內(nèi)得到結(jié)果，而且特異性非常好。為避免在基因的RT-PCR中出現(xiàn)假陰性結(jié)果，Balamurugan等提出了在單管中進(jìn)行的針對N和M基因的一步多重RT-PCR。

（3）環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增：目前已經(jīng)建立了針對小反芻獸疫病毒N基因和M基因的一步法反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)[7]，通過在保守區(qū)域設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，在63 ℃條件下經(jīng)大片段酶的擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)目的核酸片段的大量擴(kuò)增，由于在反應(yīng)時加入了熒光指示試劑，檢測結(jié)果可用肉眼直接判定，避免了電泳操作帶來的污染問題，該方法特異性和靈敏度均較高。LAMP配合使用實(shí)時檢測設(shè)備，使該技術(shù)在田間或野外具有廣泛的應(yīng)用前景。

（4）納米金標(biāo)記核酸探針：陶春愛[8]等利用納米金建立了檢測小反芻獸疫病毒的快速方法，靈敏度高和操作簡單，所需檢測時間僅需要1.5 h，初步檢測PPRV核酸最低濃度可達(dá)10 fmol/L。

2.2.5 血清學(xué)檢測

（1）病毒中和試驗：病毒中和試驗具有很強(qiáng)的特異性可以區(qū)分PPR和RP血清抗體，但需要至少7 d，花費(fèi)時間較長，并且需要實(shí)驗室具備細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備[9]。

（2）間接ELISA：Zhang等使用大腸桿菌表達(dá)的PPRV西藏株的N蛋白作為抗原，建立間接ELISA，通過對697份血清樣品的檢測報告顯示，c-ELISA商品化試劑盒相比，該方法的靈敏性和特異性為96.7%和96.1%。

（3）阻斷ELISA：阻斷ELISA與c-ELISA的不同之處是c-ELISA將待檢血清和單克隆抗體兩種試劑同時加入；b-ELISA將待檢血清先與預(yù)先固相包被的PPRV抗原反應(yīng)，然后再與單抗孵育，產(chǎn)生的靈敏性和特異性均優(yōu)于c-ELISA方法[10]。b-ELISA被證明與VNT的靈敏性和特異性接近，更簡便更快，可以替代VNT用于小反芻獸疫流行病學(xué)監(jiān)測。

（4）競爭ELISA：競爭ELISA是OIE規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)的檢測的方法之一。建該方法是在抗PPRV單克隆抗體與血清中的抗體競爭結(jié)合PPRV抗原位點(diǎn)基礎(chǔ)之上建立的。Zhang等建立了基于N蛋白抗原表位的c-ELISA，用于檢測PPRV西藏毒株的抗體，與商品化試劑盒相比較測試1039份血清樣品，其敏感性和特異性分別為96.18%和91.29%。龍云鳳等利用建立的cELISA方法對222份血清樣品進(jìn)行檢測，與參考試劑盒相比較得到98.20%的符合率[11]。

（5）夾心ELISA：夾心ELISA是用多克隆抗體捕獲臨床樣品中的PPRV抗原，用針對蛋白的單抗監(jiān)測捕獲的抗原。Saravanan等建立的s-ELISA方法特異性達(dá)92.8%，敏感性達(dá)88.9%，且在2 h內(nèi)即可獲得實(shí)驗結(jié)果，特別適用于臨床樣品的檢測[12]。

3 PPR的預(yù)防

PPR的發(fā)病率和死亡率較高，目前無有效的治療性藥物，而利用RNA或納米顆粒干擾技術(shù)的治療方法存在一定的局限性且研究尚不深入，因此對該病的預(yù)防主要依靠疫苗的免疫接種。在缺乏商品化疫苗的年代，采用抗血清首免及全血加強(qiáng)免疫的方式免疫動物，可起到一定的疫病預(yù)防作用。隨著20世紀(jì)80年代PPRV野毒株毒力的成功致弱及同源弱毒苗的商品化，上述古老的免疫方式隨之淘汰。由于PPRV和RPV存在的抗原交叉性，牛瘟弱毒苗曾經(jīng)作為異源疫苗用于PPR的防控。由于PPR弱毒苗免疫持續(xù)期長、免疫效力高目前已得到廣泛應(yīng)用。但其也具有一定確缺點(diǎn)不能區(qū)分免疫動物和自然感染動物等。

新一代候選疫苗，如活病毒載體疫苗，由于可攜帶單一保護(hù)性抗原基因，因此誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不同于自然感染情況，從而可區(qū)分免疫動物和自然感染動物。然而，這類疫苗目前還處在研究階段，并沒有達(dá)到商品化，現(xiàn)在的研究為將來的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。具有DIVA特性的新型疫苗的研制尤為重要，有利于該病的防控，更利于某個地區(qū)長期的血清學(xué)監(jiān)測。就目前的研究現(xiàn)狀而言，活病毒載體疫苗最有希望成為DIVA疫苗的候選。

小反芻獸疫從1942年發(fā)現(xiàn)至今，人們對其的研究工作一直從未停歇，致力于制定一個持久而協(xié)調(diào)的方案來控制和根除疾病，借助于牛瘟根除的歷史經(jīng)驗，目前更為迫切的是需要一個類似于全球消滅牛瘟的國際性項目，以便指導(dǎo)全球性的消滅小反芻獸疫。