山東地區(qū)1例肉雞養(yǎng)殖場大腸桿菌噬菌體的分離和解譜鑒定

魏甜甜

（青島市即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東青島 266200）

大腸桿菌是引發(fā)雞腸道疾病的主要致病菌，嚴(yán)重危害畜禽健康，影響畜禽產(chǎn)量和質(zhì)量，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[1～3]。隨著細(xì)菌耐藥譜不斷擴(kuò)展，研究畜禽新型抗菌藥物對解決耐藥性問題至關(guān)重要。噬菌體治療有明顯的優(yōu)勢，未來對其應(yīng)用價值的研究將會成為畜禽抗菌藥物研究的重點。

本試驗以從山東地區(qū)某肉雞場發(fā)病肉雞體內(nèi)采集的24株致病性大腸桿菌為宿主菌，從墊料中分離噬菌體，并檢測分離到的噬菌體的裂解譜，選取其中的寬噬噬菌體進(jìn)行保存及研究，為治療雞源大腸桿菌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

菌種：山東地區(qū)某肉雞場發(fā)病肉雞體內(nèi)采集的24株致病性大腸桿菌為宿主菌。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)蘇培養(yǎng)菌種

用細(xì)菌接種環(huán)分別挑取適量-20℃甘油凍存的24株致病性大腸桿菌菌液，在SS瓊脂培養(yǎng)基上分區(qū)劃線分離單個菌落，將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)16～24 h。

制備菌懸液：在已滅菌的超凈臺上，分別挑取粉紅色單個菌落，接種到5 ml營養(yǎng)LB肉湯的試管中，于空氣浴振蕩器37℃ 200 rpm過夜培養(yǎng)得菌懸液，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

制備混合菌懸液：分別從已培養(yǎng)好的5 ml菌懸液中各取100 μl菌液加入到盛有 LB肉湯20 ml的三角瓶中，空氣浴振蕩器37℃200 rpm振蕩培養(yǎng)6 h得混合菌懸液，4℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 處理墊料

將墊料5g加入生理鹽水10 ml中，并用玻璃棒攪拌至均勻，呈糊狀備用（有條件的可以用篩糞器將其中雜質(zhì)篩除）。

1.2.3 噬菌體的分離與鑒定

制備噬菌體增殖液：取墊料2 g加入上述混合菌懸液中，充分混合均勻，于空氣浴振蕩器中37℃ 160 rpm培養(yǎng)10 h，用于噬菌體的分離培養(yǎng)。

本試驗采用雙層平板法對分離到的噬菌體進(jìn)行鑒定，將已配好2%的底層瓊脂熔化后冷卻至50℃左右，傾注入無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后倒置以備用。

將上述噬菌體增殖液靜置20 min后，取出15 ml 10000 rpm離心5 min，將其中的上清液用無菌針頭式濾器過濾除去細(xì)菌碎片，得到無菌濾液，將得到的濾液裝于EP管中備用。各取100 μl菌懸液分裝于24個EP管中，再各加上100 μl上述濾液，用力振蕩使菌懸液與噬菌體濾液充分混勻后，40℃水浴15 min，再將所得的混合液立即加入到已融化好的上層營養(yǎng)瓊脂中（55℃），用手快速搓試管使混合懸液與上層瓊脂混勻后，快速對號倒入已凝固好的底層瓊脂平板上，旋轉(zhuǎn)平皿輕搖平板使上層營養(yǎng)瓊脂分布均勻，待上層營養(yǎng)瓊脂凝固后，倒置放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 h后，第一次觀察有無噬菌斑，觀察完畢后，再次培養(yǎng)至6～8 h，第二次觀察有無噬菌斑及其噬菌斑的大小形態(tài)。結(jié)果表明，如果濾液中存在著噬菌體，既可在平板上形成蠶蝕狀的空斑，與灰白色的菌苔形成對比，即為噬菌斑[5～6]。

1.2.4 噬菌體的純化

通過雙層平板法我們可以在平板上得到肉眼可見，大小不一，形態(tài)各異，圓形、清晰、透明的噬菌斑。因此，需要對分離到的噬菌體進(jìn)行純化。操作過程如下：將鑷子在酒精燈上滅菌，待冷卻后，挑取單個噬菌斑置于盛有1 ml無菌生理鹽水的EP管中，40℃水浴30 min后4000 rpm離心10 min，取出上清得到噬菌體的浸出液繼續(xù)采用雙層平板法。重復(fù)上述步驟3～5次，得到大小均勻一致、透明的噬菌斑。

1.2.5 噬菌體的增殖

通過雙層平板法得到的噬菌體的效價很低，需要進(jìn)行噬菌體的增殖，增加噬菌體的效價。

制備噬菌體浸出液：用已滅菌的鑷子挑取單個噬菌斑于500 μl的生理鹽水中，40℃水浴30 min后4000 rpm離心10 min，過濾之后得噬菌體的浸出液。

選用LB肉湯液體培養(yǎng)基對噬菌體進(jìn)行增殖，操作過程如下：各取200 μl的單一菌懸液和200 μl的噬菌體浸出液加入到盛有5 ml的LB肉湯液體培養(yǎng)基中，分別相應(yīng)編號，空氣浴振蕩器37℃ 160 rpm振蕩培養(yǎng)3～4 h，期間每隔半個小時觀察1次，可見菌懸液和噬菌體浸出液的混合液由渾濁變清亮的整個過程。待混合液變澄清后裝入到10 ml的無菌離心管中，4000 rpm離心10 min。

取出上清液與等量的菌懸液混合均勻加入60%LB甘油4℃保存以備用[7～9]。

1.2.6 噬菌體裂解譜的測定

本試驗采用雙層平板法對噬菌體進(jìn)行24株致病性大腸桿菌裂解譜的測定。所用方法如下：分別挑取24株大腸桿菌的單菌落接種于盛有5 ml的LB肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃ 160 rpm振蕩培養(yǎng)10 h，得各株大腸桿菌的菌懸液。

為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，需對噬菌體濾液進(jìn)行倍比稀釋。方法如下：分別取90 μl的生理鹽水于3只無菌的EP管，標(biāo)號1、2、3。取10 μl的噬菌體濾液于標(biāo)號為1的EP管中，用微量移液器充分混合均勻后取10 μl的混合液于標(biāo)號為2的EP管中，重復(fù)上述步驟。

各取20 μl菌懸液和20 μl噬菌體混合液37℃溫箱中孵育15 min后，加入到已融化好的上層瓊脂培養(yǎng)基中（55℃）中，手搓試管，使混合懸液與上層培養(yǎng)基混勻，混勻后迅速對號倒入已準(zhǔn)備好的底層瓊脂培養(yǎng)基上，輕搖平皿使上層培養(yǎng)基鋪滿平板，凝固后37℃倒置培養(yǎng)3～6 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離噬菌體及測定裂解譜

通過利用雙層平板法從墊料中分離到兩株噬菌體：BP13、BP14，噬菌斑的形態(tài)、大小見圖1。

圖1 噬菌斑的形態(tài)

由圖1可以看出，噬菌體BP13，BP14均可以形成邊緣整齊透明的噬菌斑。BP13、BP14噬菌體經(jīng)過培養(yǎng)4～6 h后可得到直徑約1 mm的噬菌斑。

2.2 噬菌體裂解譜

采用雙層平板法對噬菌體進(jìn)行裂解譜的測定，采用LB肉湯液體培養(yǎng)基的方法噬菌體BP13、BP14的裂解譜進(jìn)行鑒定（見表1）。

表1 2株噬菌體裂解譜的測定結(jié)果

采用雙層平板法，以24株致病性大腸桿菌為宿主菌，噬菌體BP13對致病性大腸桿菌的裂解譜最為廣泛，能完全裂解3號、7號、8號、9號、10號、21號、23號、24號、25號、34號、39號、44號，能使27號大腸桿菌的雙層平板上有噬菌斑，不能使其LB肉湯液體培養(yǎng)基變澄清，寬噬率為50%。BP14能完全裂解21號，22號，寬噬率為8.33%，能使11號、18號、29號、34號大腸桿菌的LB肉湯液體培養(yǎng)基變澄清，不能使其雙層平板上出現(xiàn)噬菌斑。噬菌體BP14及BP13裂解大腸桿菌的時間有差異（見表2）。

表2 2株噬菌體澄清所需時間

由表2可知，采用LB肉湯液體培養(yǎng)基可觀察到2株噬菌體的增殖速度不同，噬菌體BP13比BP14裂解速度快。同一噬菌體對不同的致病性大腸桿菌的裂解時間也不同。BP13能夠使34號、39號致病性大腸桿菌快速裂解，裂解速度最快。BP14能夠使21號致病性大腸桿菌快速裂解，裂解速度最快。

3 討論

3.1 關(guān)于噬菌體的分離

通過對噬菌體進(jìn)行多次的分離后，在雙層瓊脂平板上得到了透明規(guī)則，直徑約為1 mm的噬菌斑。分離噬菌體時需要注意事項如下：

（1）采集墊料：需要注意不能只取單只雞的或只取自一堆，應(yīng)取相隔較遠(yuǎn)不同排或是不同雞舍的墊料，因為單只雞體內(nèi)含有噬菌體的可能性非常小，同時這樣也避免了只是取到同一種噬菌體的可能性，大堆墊料中環(huán)境復(fù)雜細(xì)菌的種類多因此含有不同種噬菌體的概率也比較大[10～11]。（2）墊料處理：初步處理時最好把墊料放入無菌容器內(nèi)，并加入生理鹽水?dāng)嚦珊隣詈?，用篩糞器或紗布將墊料中的大顆粒去除，防止初次取增殖液的時堵塞移液槍。同時使墊料中的噬菌體分布均勻，避免加樣的時候所加入的墊料中不含有噬菌體。（3）將墊料2 g加入到混合菌懸液中振蕩搖勻，輕輕吸取上層液體，離心后要輕拿輕放。離心后的液體注意一定要注意過濾，防止分離噬菌體時雙層平板上可能出現(xiàn)雜菌，影響試驗結(jié)果。（4）初次分離得到的噬菌斑可能形狀各異，大小不一。當(dāng)出現(xiàn)疑似噬菌斑時，需要經(jīng)過驗證加以確定。用無菌生理鹽水浸潤可疑噬菌斑30～45 min，使噬菌體游離出來，離心之后再做雙層平板。當(dāng)在雙層平板上再次出現(xiàn)相似噬菌斑時，才能證實從墊料中分離到了相應(yīng)的噬菌體。當(dāng)分離到相應(yīng)噬菌體后，選取大小適合的噬菌斑進(jìn)行純化，才能得到理想效果的噬菌斑。

3.2 關(guān)于噬菌體裂解譜的測定

雙層平板法從墊料中分離得到2個噬菌斑，經(jīng)過裂解譜的測定發(fā)現(xiàn)這是兩株不同的噬菌體。再進(jìn)一步用LB肉湯培養(yǎng)基檢驗發(fā)現(xiàn)這兩種噬菌體的生長時間，以及裂解大腸桿菌的程度都不相同，可以確定這是兩種不同的噬菌體。

由于本試驗的目的是篩選出寬噬噬菌體，還需要對分離到的噬菌體進(jìn)行純化和增殖。經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)，BP13號噬菌體可以完全裂解3號、7號、8號、9號、10號、21號、23號、24號、25號、34號、39號、44號致病性大腸桿菌，裂解率達(dá)50%。BP14號噬菌體可以完全裂解21號、22號致病性大腸桿菌，裂解率達(dá)8.33%。

4 小結(jié)

從墊料中分離出兩株不同噬菌體，并利用雙層平板法和24株致病性大腸桿菌對分離到的噬菌體進(jìn)行裂解譜的測定。BP13可裂解12株致病性大腸桿菌型細(xì)菌，寬噬率為50.0%；BP14可裂解2株致病性大腸桿菌型細(xì)菌，寬噬率為8.33%。