質(zhì)粒介導的替加環(huán)素耐藥機制的研究進展

王知任，李荷楠

1 概述

替加環(huán)素（tigecycline）是四環(huán)素類衍生的新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物，其在米諾環(huán)素的中心構(gòu)架上增加了9-叔丁基-甘氨酰胺基側(cè)鏈修飾結(jié)構(gòu)[1]。替加環(huán)素進入細菌后可逆地結(jié)合于核糖體30S亞單位中的16S rRNA，阻斷tRNA進入A位點從而抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯過程。通過結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，替加環(huán)素與核糖體30S亞基結(jié)合的同時，也與核糖體亞基H34殘基相互作用，所以兩者的結(jié)合比其他四環(huán)素類藥物更牢固，抑制細菌蛋白合成的能力是四環(huán)素的20倍[2]。替加環(huán)素對除變形桿菌屬和假單胞菌屬外大多數(shù)革蘭陽性和革蘭陰性菌都有較強的抗菌活性，包括腸桿菌科、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌屬、肺炎鏈球菌等[3]。由于其9位上的大取代基形成了空間位阻，替加環(huán)素不受大多數(shù)抗菌藥物耐藥機制影響，同時還克服了四環(huán)素的耐藥機制，如編碼核糖體保護蛋白的tet(O)、編碼外排泵的tet(K)和tet(A)等[4]。由于替加環(huán)素廣泛的體外抗菌活性，它和黏菌素被視作碳青霉烯類多重耐藥革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”，然而近年來隨著其應(yīng)用愈加廣泛，耐藥性的產(chǎn)生不可避免，替加環(huán)素耐藥機制的研究也呈趨勢性發(fā)展。

在已報道的替加環(huán)素耐藥機制中，細菌外排泵系統(tǒng)起主要作用。RND型外排系統(tǒng)（resistancenodulation-division efflux systems）中特征性外排泵AdeABC、AdeFGH和AdeIJK表達活性過度增加，與雙組份調(diào)控系統(tǒng)adeR和adeS的缺失和突變均可導致替加環(huán)素耐藥[5]。此外，替加環(huán)素敏感性降低的原因還有修飾酶Tet(X)滅活替加環(huán)素、plsC基因突變改變細胞膜滲透性、rpsJ基因突變導致替加環(huán)素與核糖體之間親和力下降等[6]。近期，有研究報道替加環(huán)素的耐藥性可以由攜帶耐藥基因的質(zhì)粒通過接合的方式在細菌中傳播[7]，進而可能引起醫(yī)院內(nèi)部耐藥菌的暴發(fā)。耐藥質(zhì)?？梢栽诓煌N類的細菌之間介導耐藥的水平轉(zhuǎn)移，其取決于宿主范圍的寬窄、接合特性和效率。可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒是傳播耐藥基因的理想載體，因為它們可以攜帶并表達多種耐藥基因，并且經(jīng)常攜帶能夠促進其向另一細菌轉(zhuǎn)移的基因。在質(zhì)粒內(nèi)，耐藥基因通常由轉(zhuǎn)座子攜帶，轉(zhuǎn)座子可以在質(zhì)粒之間轉(zhuǎn)移耐藥基因或?qū)⒛退幓蛴谌旧w中運進或移出[8]。位于質(zhì)粒上的耐藥基因、毒力基因或黏附因子為宿主提供了優(yōu)勢性狀，使質(zhì)粒得以進化為細菌基因組的組成部分[9]，質(zhì)粒與整合子和轉(zhuǎn)座子等遺傳元件一起利用多種機制參與了這些性狀的傳播，從而消除了不同種類細菌之間的屏障[10]。質(zhì)粒介導的耐藥性的產(chǎn)生和傳播目前已經(jīng)成為耐藥菌感染和暴發(fā)的重要原因之一，本文對近期質(zhì)粒介導的替加環(huán)素耐藥機制的研究進展進行綜述，已經(jīng)報道的質(zhì)粒介導的替加環(huán)素耐藥機制涉及的基因包括tet(A)、tet(X)、tet(M)和tet(L)。

2 編碼四環(huán)素外排泵的tet(A)基因

tet(A)基因編碼屬于MFS家族的蛋白外排泵，通常定位于轉(zhuǎn)座子Tn1721上，并在質(zhì)粒和染色體上均可被檢測到。Tn1721與接合質(zhì)粒相關(guān)，所以tet(A)基因?qū)⒂兄趯λ沫h(huán)素類抗生素耐藥性的傳播[11]。普遍認為由于替加環(huán)素可以抑制蛋白質(zhì)的合成，tet(A)基因隨著質(zhì)粒接合進入細菌內(nèi)就無法進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此不會引起細菌對替加環(huán)素的耐藥。但是多項研究發(fā)現(xiàn)，tet(A)基因在肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌和鮑曼不動桿菌等革蘭陰性菌中能升高替加環(huán)素最低抑菌濃度（MIC）。

通過持續(xù)監(jiān)測1例接受替加環(huán)素治療的癌癥患者的肺炎克雷伯菌分離株，發(fā)現(xiàn)在治療的早期階段分離株對替加環(huán)素敏感，治療13 d后分離出了與早期克隆一致的耐藥菌株，通過全基因組測序和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)耐藥株存在tet(A)基因的點突變導致氨基酸改變[12]。耐藥菌株與標準菌株ATCC 25922接合成功，接合子的替加環(huán)素MIC從0.125 mg/L增加至8 mg/L，增加了64倍，說明tet(A)基因突變可以引起替加環(huán)素MIC升高，并且這種耐藥性還具有傳播能力。后續(xù)通過DNA印跡雜交和PCR雜交驗證了突變的tet(A)基因可以通過可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒介導。這說明在替加環(huán)素的選擇性壓力下，可能發(fā)生tet(A)突變并導致治療失敗。

在食品和臨床分離的腸炎沙門菌株中，檢測到多個tet(A)基因移碼突變的突變體[13]。DNA印跡雜交確定突變的tet(A)基因位于質(zhì)粒，消除質(zhì)粒后的菌株替加環(huán)素MIC均低于野生型分離株，說明tet(A)突變基因降低了菌株對替加環(huán)素的敏感性。在未對整個片段進行測序的情況下，用限制酶BsaWI消化tet(A)的PCR擴增產(chǎn)物來確定tet(A)是否攜帶突變，發(fā)現(xiàn)所有攜帶tet(A)的擴增產(chǎn)物均被切割，說明突變存在于相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域間環(huán)路區(qū)域序列中，于是猜測替加環(huán)素耐藥的增加可能是由于Tet(A)蛋白結(jié)構(gòu)域間環(huán)C3區(qū)內(nèi)的多個移碼突變影響了替加環(huán)素的底物特異性[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣單胞菌和黏質(zhì)沙雷菌等細菌中均檢測到與質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等可移動遺傳元件有關(guān)的突變的tet(A)基因，并且在不同國家的食品、臨床標本、環(huán)境和人類菌群中均有發(fā)現(xiàn)[13]。

除了tet(A)基因的突變外，有研究發(fā)現(xiàn)RND型外排泵轉(zhuǎn)運子AdeABC和AdeIJK可以與tet(A)基因協(xié)同作用使鮑曼不動桿菌獲得替加環(huán)素耐藥性[15]。敲除adeAB（ΔadeAB）的鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性明顯增強，adeIJ的敲除（ΔadeIJ）也小幅增強對替加環(huán)素敏感性，表明adeAB是參與替加環(huán)素外排的主要RND外排泵。adeFG敲除的菌株在替加環(huán)素存在的情況下顯示出與野生型相似的易感性表型，可能是由于adeG的轉(zhuǎn)錄水平較低。該研究構(gòu)建了tet(A)表達質(zhì)粒，以敲除不同RND基因的鮑曼不動桿菌標準菌株為宿主進行轉(zhuǎn)化后檢測替加環(huán)素MIC，發(fā)現(xiàn)所有菌株對替加環(huán)素的敏感性降低，包括替加環(huán)素敏感的ΔadeAB和ΔadeIJ菌株，證實了Tet(A)在替加環(huán)素外排活性中的重要作用。對暴露于替加環(huán)素時tet(A)基因表達進行RT-PCR，結(jié)果顯示tet(A)表達量在有替加環(huán)素存在的情況下顯著增加，說明替加環(huán)素耐藥性的主要決定因素是tet(A)，RND型轉(zhuǎn)運子AdeABC和AdeIJK在外排中起協(xié)同和/或疊加作用。Tet(A)與RND型轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)同作用的轉(zhuǎn)運機制對于深入了解外排泵系統(tǒng)介導的替加環(huán)素耐藥機制具有重要提示意義。

3 編碼替加環(huán)素滅活酶的tet(X)基因家族

Tet(X)蛋白是黃素依賴性單加氧酶，可以修飾四環(huán)素和米諾環(huán)素，需要黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、鎂離子和氧才能發(fā)揮活性[16]。在NADPH存在時Tet(X)可以修飾替加環(huán)素，表明替加環(huán)素同樣是Tet(X)的底物，進一步利用液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)其可在替加環(huán)素的碳11a處進行羥基化。研究還通過羥基化前后的替加環(huán)素MIC和阻斷蛋白合成能力的定量比對，發(fā)現(xiàn)羥基化后的替加環(huán)素MIC升高同時抑制蛋白質(zhì)翻譯的能力更弱。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的tet(X)基因有tet(X1)～tet(X6)，但是根據(jù)命名中心的新標準，所有tet(X)變異體基因都只能稱為tet(X)，為了描述方便本文中仍沿用舊稱，目前僅有tet(X3)、tet(X4)和tet(X5)在質(zhì)粒上有報道。

一項基于全基因組測序的研究從豬來源的鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌的替加環(huán)素耐藥分離株中分別發(fā)現(xiàn)了tet(X3)、tet(X4)基因，兩者均位于質(zhì)粒上[17]。tet(X3)和tet(X4)的DH5α轉(zhuǎn)化子的替加環(huán)素MIC是原來的64倍和128倍，攜帶tet(X3)的質(zhì)粒也成功接合到一株攜帶blaOXA-23基因的鮑曼不動桿菌分離株中，替加環(huán)素的MIC升高到原來的128倍。小鼠感染模型證實tet(X3)和tet(X4)能夠在體內(nèi)介導替加環(huán)素耐藥，并可能導致臨床治療失敗。經(jīng)過同源建模和色譜質(zhì)譜分析證實了Tet(X3)和Tet(X4)通過對替加環(huán)素進行羥基化破壞胞內(nèi)的藥物。為了研究二者的遺傳環(huán)境，實驗還進行了三代測序和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)二者在各自的質(zhì)粒上兩側(cè)都與插入序列ISVsa3相鄰從而形成環(huán)狀I(lǐng)SVsa3-tet(X3/4)中間體，tet(X3)和tet(X4)基因通過ISVsa3介導的轉(zhuǎn)座在菌株之間傳播。ISVsa3元件的普遍存在以及環(huán)狀I(lǐng)SVsa3-tet(X)中間體的形成和轉(zhuǎn)座使tet(X)變體基因在不同質(zhì)粒間有潛在易位和整合到染色體上的可能性。動物糞便分離細菌中tet(X3)和tet(X4)的高檢出率很可能是由于飼養(yǎng)中大量四環(huán)素的選擇性壓力造成的，推測tet(X)變異體正在成為最重要的替加環(huán)素耐藥的決定因素。此外還進行了數(shù)據(jù)庫挖掘和回顧性篩選分析，證實tet(X3)和tet(X4)在臨床細菌中廣泛存在，并會導致其對替加環(huán)素的耐藥，所以需要加強臨床替加環(huán)素耐藥病原體中tet(X)變異體的監(jiān)測。

還有研究在鮑曼不動桿菌臨床分離株中檢測到一種新的質(zhì)粒介導的高水平替加環(huán)素耐藥tet(X)基因變異體tet(X5)，其與tet(X3)和tet(X4)結(jié)合位點相似，對四環(huán)素的親和力也相近[18]。tet(X5)重組載體轉(zhuǎn)化子的替加環(huán)素MIC增加4～32倍?？赡苁怯捎谫|(zhì)粒中缺乏接合元件，接合實驗未能成功，但是菌株能夠成功轉(zhuǎn)化也表明該質(zhì)粒可以在不動桿菌屬中復(fù)制。利用tet(X)與米諾環(huán)素的復(fù)合體為模板進行同源建模，并將該模型疊加到Tet(X2)的X射線結(jié)構(gòu)上，結(jié)果顯示Tet(X5)的四環(huán)素結(jié)合位點與Tet(X2)的基本相同，這與Tet(X3)和Tet(X4)得到的結(jié)果相同，說明這組蛋白質(zhì)之間可能具有高度序列同一性。為了探究其遺傳環(huán)境，實驗通過單分子實時測序得到了tet(X5)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)tet(X5)中心區(qū)域的兩側(cè)同樣有兩個ISVsa3拷貝形成了環(huán)狀中間體，結(jié)合之前的研究結(jié)果推測其也有通過ISVsa3元件在菌株之間進行轉(zhuǎn)座的可能，表明插入序列ISVsa3可能在所有檢測到的tet(X)變異體的傳播中起重要作用。可以推測，在質(zhì)粒上的耐藥基因兩側(cè)若有相同插入序列存在則可能形成環(huán)狀中間體并通過轉(zhuǎn)座在細菌之間進行耐藥的傳播。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)雞場的家禽樣本和土壤樣本中替加環(huán)素耐藥的不動桿菌中含有共攜帶新型tet(X)和碳青霉烯耐藥基因blaNDM-1的質(zhì)粒，這些不動桿菌包括印度不動桿菌(A. indicus)、遜德勒不動桿菌(A. schindleri)、洛菲不動桿菌(A.lwoffii)和一種未知的不動桿菌[19]。通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)了18個tet(X)和blaNDM-1共攜帶的分離株，其中15個攜帶的是新型tet(X)基因，15個中有6個菌株的新型tet(X)和blaNDM-1共定位于同一質(zhì)粒。由于共攜帶tet(X)和blaNDM-1的質(zhì)粒未能成功接合進入受體菌，于是進行了轉(zhuǎn)化試驗，成功驗證了質(zhì)粒介導的替加環(huán)素耐藥性。通過單分子實時測序獲得了完整的共攜帶新型tet(X)和blaNDM-1的質(zhì)粒序列，發(fā)現(xiàn)6個質(zhì)粒含有相似的兩個多藥耐藥區(qū)和質(zhì)粒骨架結(jié)構(gòu)，包括編碼質(zhì)粒復(fù)制、維持和穩(wěn)定的基因，并且其中5個質(zhì)粒與第6個質(zhì)粒pCMG3-2-1在核酸序列上有較高一致性，推測是在其基礎(chǔ)上通過序列插入、置換、刪除和轉(zhuǎn)位形成的。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)tet(X)基因的下游都存在插入序列ISCR2，blaNDM-1均位于Tn125轉(zhuǎn)座子上，這種基因環(huán)境被認為與tet(X)和blaNDM-1的可移動性有關(guān)。盡管未能證明這類質(zhì)粒的接合能力，也未能發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移操縱子，但是在不同的物種、來源和地理區(qū)域中均發(fā)現(xiàn)高度相似的質(zhì)粒，暗示該質(zhì)粒具有可水平轉(zhuǎn)移性。研究還發(fā)現(xiàn)除了家禽外其他鳥類物種也含有共攜帶質(zhì)粒，水禽樣本中共攜帶分離株的高檢出率表明這些細菌可能通過被污染的水系統(tǒng)傳播。令人擔憂的是，碳青霉烯類和替加環(huán)素耐藥基因的結(jié)合將同時使兩類最重要的抗菌藥物失去活性，考慮到動物、環(huán)境和人類之間的密切關(guān)系，應(yīng)該密切監(jiān)測這些菌株和質(zhì)粒在人類社會中的進一步傳播。

4 編碼MSF泵的tet(L)和編碼核糖體保護蛋白tet(M)

目前，在革蘭陽性菌中也發(fā)現(xiàn)了兩個四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥決定簇——編碼MFS超家族外排泵的tet(L)和編碼核糖體保護蛋白的tet(M)[20]。研究將7株替加環(huán)素MIC在0.5～12 mg/L的屎腸球菌臨床分離株在非選擇性平板上培養(yǎng)115 d，以檢測其耐藥穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)7株中有2株MIC維持穩(wěn)定、3株略有降低、還有2株完全喪失耐藥，說明耐藥性并不穩(wěn)定。進而利用含高濃度替加環(huán)素的瓊脂平板培養(yǎng)菌株，發(fā)現(xiàn)其中1株耐藥丟失株的原分離株在培養(yǎng)4周后MIC升高至64 mg/L，成為耐藥增強株。將這一分離株的原始株、耐藥丟失株和耐藥增強株進行全基因組測序和單分子實時測序，并經(jīng)過S1-PFGE驗證后發(fā)現(xiàn)其原始分離株和耐藥增強株含有攜帶tet(M)和tet(L)基因的質(zhì)粒，而耐藥性丟失株則丟失了該質(zhì)粒，說明該屎腸球菌的替加環(huán)素耐藥由質(zhì)粒介導，且可以丟失。Tet(M)是核糖體保護蛋白，阻礙四環(huán)素與23S rRNA結(jié)合；Tet(L)是MFS外排泵家族的一員，可以外排四環(huán)素卻對替加環(huán)素無效，但是在耐藥增強株中發(fā)現(xiàn)成熟Tet(L)蛋白的假定底物結(jié)合位點出現(xiàn)了氨基酸取代，推測該突變在替加環(huán)素耐藥中發(fā)揮了作用。通過電轉(zhuǎn)將tet(M)、tet(L)和tet(L)突變體的表達載體引入革蘭陽性菌單核細胞增生李斯特菌中表達，結(jié)果顯示天然Tet(L)對替加環(huán)素MIC的影響很小，突變的Tet(L)外排泵和核糖體保護蛋白Tet(M)均使替加環(huán)素MIC值升高數(shù)倍，這也就表明即使在非天然宿主中Tet(L)和Tet(M)也可介導替加環(huán)素的耐藥。此研究并沒有直接驗證其可轉(zhuǎn)移性，所以質(zhì)粒是否存在轉(zhuǎn)座子或插入序列而具有傳播耐藥的能力尚未得知。另外逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR也驗證了耐藥增強株中tet(M)和tet(L)均過表達，tet(M)和tet(L)拷貝數(shù)和/或表達的增加使腸球菌的替加環(huán)素耐藥增加。由此可見對于革蘭陽性菌的替加環(huán)素耐藥監(jiān)測也不可忽視，質(zhì)粒耐藥基因的機制仍需進一步研究。

5 小結(jié)

隨著臨床和非臨床環(huán)境中四環(huán)素類抗菌藥物的廣泛使用，動物和人類細菌中逐漸出現(xiàn)質(zhì)粒介導的替加環(huán)素耐藥菌株，且其傳播風險逐漸增高。我們需要快速破解新發(fā)耐藥質(zhì)粒的耐藥機制，同時也要對已知耐藥質(zhì)粒的機制進行進一步探究，提高質(zhì)粒對于耐藥傳播重要性的認識，進一步加強對于替加環(huán)素耐藥的監(jiān)測和研究。