攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌研究進(jìn)展

余 艷，劉淑敏，杜 艷

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是一種重要的條件致病菌，在宿主免疫功能低下、菌群失調(diào)時(shí)，可引起呼吸道感染、泌尿生殖道感染、傷口感染、血流感染以及新生兒腦膜炎等[1]。碳青霉烯類藥物具有良好的細(xì)胞通透性及高度的酶穩(wěn)定性，是治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）和頭孢菌素酶（AmpC酶）陰溝腸桿菌感染的主要藥物，隨著該類抗生素的廣泛應(yīng)用，全球各地相繼出現(xiàn)碳青霉烯耐藥陰溝腸桿菌（CR-ECL）播散流行。CHINET耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，2007年陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥率＜1.0%，2017年，對(duì)亞胺培南、美羅培南和厄他培南的耐藥率分別上升到6.9%、7.0%和8.2%，表明陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥趨勢(shì)十分嚴(yán)峻[2]。

產(chǎn)碳青霉烯酶是陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機(jī)制，其中以新德里金屬β內(nèi)酰胺酶-1（NDM-1）最受關(guān)注。產(chǎn) NDM-1陰溝腸桿菌于 2007 年首次出現(xiàn)在印度，然后迅速播散到世界各地[3]。目前研究顯示在CR-ECL中，NDM-1檢出率最高，可能是CR-ECL的主要耐藥機(jī)制[2,4-6]。產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌常表現(xiàn)為多重耐藥，這種“超級(jí)細(xì)菌”的播散流行，是對(duì)臨床治療的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和對(duì)公共健康的重大威脅。

1 NDM-1概述

NDM-1共有270個(gè)氨基酸，分子量約28 kDa，氨基酸序列與其他已知的金屬β內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamase，MBL）相比，一致性不足33%[7]，其活性位點(diǎn)含有兩個(gè)鋅離子，NDM-1與底物之間的相互作用通過(guò)鋅離子實(shí)現(xiàn)，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）能抑制其活性[8]。隨著環(huán)境壓力的變化，酶會(huì)發(fā)生突變以提高穩(wěn)定性和適應(yīng)性，從而導(dǎo)致功能發(fā)生變化。目前已鑒定出24種NDM-1突變亞型，命名NDM-1～NDM-24[9]。與NDM-1相比，其他突變亞型通常在氨基酸序列不同位置發(fā)生1～5個(gè)氨基酸替換，以M154L替換最常見，值得注意的是，所有突變均未發(fā)生在活性位點(diǎn)內(nèi)。已經(jīng)在陰溝腸桿菌中檢測(cè)到的突變亞型有NDM-4、5、7、22[6,9-10]。研究表明僅在鋅缺乏的條件下檢測(cè)到部分突變亞型的耐藥性增加，而且NDM-1正在進(jìn)化以提高鋅親和力和鋅活性，從而應(yīng)對(duì)感染部位有限的鋅濃度，表明鋅缺乏可能是驅(qū)動(dòng)NDM-1進(jìn)化的關(guān)鍵因素[10]。產(chǎn)NDM-1菌株給臨床治療和公共健康帶來(lái)極大威脅,原因主要有以下幾點(diǎn)：①在這些細(xì)菌中檢測(cè)到的大多數(shù)攜帶blaNDM-1基因的質(zhì)粒是可轉(zhuǎn)移的并且能夠進(jìn)行廣泛重組，表明其水平傳播的能力較強(qiáng)；②缺乏針對(duì)NDM-1的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)化表型檢測(cè)方法；③無(wú)癥狀攜帶者的患病率可能很高；④缺乏有效的抗生素來(lái)治療多重耐藥的產(chǎn)NDM-1細(xì)菌，最終導(dǎo)致感染患者出現(xiàn)高死亡率[8-9,11]。

2 流行現(xiàn)狀

2.1 國(guó)外流行現(xiàn)狀

NDM-1于2008年在印度1株肺炎克雷伯菌中首次被報(bào)道，Castanheira等[3]通過(guò)回顧性調(diào)查證實(shí)早在2007年印度就已經(jīng)出現(xiàn)了產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌，并且很多產(chǎn)NDM-1菌株都來(lái)自社區(qū)獲得性感染患者，表明blaNDM-1基因可能在環(huán)境中廣泛存在，但目前對(duì)其在社區(qū)傳播機(jī)制仍不清楚。2009年，Kumarasamy等[12]研究表明產(chǎn)NDM-1菌株在巴基斯坦、孟加拉國(guó)和英國(guó)廣泛存在，其中一半以上的感染患者至少在一年內(nèi)有印度醫(yī)療旅行史，推測(cè)產(chǎn)NDM-1菌株的傳播與印度旅行史密切相關(guān)。2013年，土耳其、尼泊爾、墨西哥、新加坡、英國(guó)等多國(guó)報(bào)道了此類細(xì)菌的醫(yī)院感染暴發(fā)，但具體流行起源尚不清楚[13-15]。美國(guó)退伍軍人健康管理局的一項(xiàng)研究顯示，在2014—2015年CR-ECL菌株的檢出率出現(xiàn)明顯增高[16]?？咕幬锬退幮在厔?shì)監(jiān)測(cè)(SMART)結(jié)果顯示，全球55個(gè)國(guó)家/地區(qū)103 960株腸桿菌科細(xì)菌中，NDM-1在CR-ECL中的檢出率占比達(dá)到了36.36%，是最常見的碳青霉烯酶[17]。另一項(xiàng)跨國(guó)研究表明在產(chǎn)MBL菌株中，NDM-1所占比例最高達(dá)到了44.2%，MBL陽(yáng)性菌株中陰溝腸桿菌排名第二，僅次于肺炎克雷伯菌，表明產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌分布廣、檢出率高[18]。目前多項(xiàng)研究顯示產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌的傳播可能與食物、水、空氣污染有關(guān)，這可能是導(dǎo)致該菌在全球迅速傳播的原因之一[8-9]。

2.2 國(guó)內(nèi)流行現(xiàn)狀

在中國(guó)，重慶醫(yī)科大學(xué)于2012年首次分離出產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌[19]，此后多次報(bào)道CR-ECL在碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）中分布最廣、耐藥率最高，NDM-1是當(dāng)?shù)谻R-ECL中最常見的碳青霉烯酶，占比達(dá)61%，出現(xiàn)產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌暴發(fā)流行[20-21]。2015年，河南報(bào)道了多所醫(yī)院分離的CR-ECL菌株中NDM-1檢出率高達(dá)72%[4]，類似的報(bào)道還出現(xiàn)在寧夏、云南、大連和青島等地[22-23]。除了這些散發(fā)報(bào)道，Jin等[5]收集了中國(guó)11個(gè)城市臨床分離的CR-ECL菌株，其中90%菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，NDM-1占68%，并發(fā)生了深圳、東莞的小規(guī)模暴發(fā)流行。同時(shí)，中國(guó)一項(xiàng)大規(guī)模研究顯示在CR-ECL中檢測(cè)到的NDM-1從2013年25%增加到2016年的53%，占碳青霉烯酶的主要地位，并且產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌已經(jīng)在全國(guó)各地廣泛播散流行，以華中、華南、華東以及西南地區(qū)為主[6]，這與王盛書[24]的報(bào)道一致。

綜上所述，產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌已經(jīng)在全球各地播散流行，形成總體散發(fā)，局部高流行的趨勢(shì)，并且產(chǎn)NDM-1是CR-ECL的主要耐藥機(jī)制。值得注意的是，由于產(chǎn)NDM-1細(xì)菌耐藥性強(qiáng)、感染者臨床癥狀不一、各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力不同以及全球廣泛傳播等因素再加上目前大部分研究是通過(guò)回顧性篩查留存標(biāo)本獲得陽(yáng)性菌株，也有少部分通過(guò)個(gè)案報(bào)道或暴發(fā)疫情檢出陽(yáng)性菌，本文所涉及的可能只是產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌實(shí)際流行情況的冰山一角，其實(shí)際分布范圍可能更廣，引起的公共衛(wèi)生問題可能更加復(fù)雜。

3 耐藥現(xiàn)狀與傳播機(jī)制

3.1 耐藥現(xiàn)狀

產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌通常表現(xiàn)為多重耐藥或泛耐藥，其耐藥機(jī)制十分復(fù)雜。由于染色體編碼的AmpC酶，陰溝腸桿菌對(duì)氨芐西林，阿莫西林-克拉維酸，頭霉素以及第一、第二代頭孢菌素具有內(nèi)在抗性。NDM-1不能水解氨曲南，但產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌常攜帶ESBL耐藥基因，會(huì)使菌株對(duì)氨曲南也耐藥，再加上氨基糖苷類、喹諾酮類等多種耐藥基因的合并表達(dá)，細(xì)菌膜孔蛋白缺失以及外排泵高表達(dá)等多種耐藥機(jī)制并存，使其成為一種很難治療的超級(jí)細(xì)菌[2,5-6,21]。研究表明部分菌株能同時(shí)攜帶兩種或兩種以上碳青霉烯酶基因，比如共表達(dá)blaNDM-1和blaKPC-2，blaNDM-1和blaIMP-1等，兩種基因共存時(shí)要比blaNDM-1基因單獨(dú)存在時(shí)耐藥性更強(qiáng)[2,25]。多黏菌素和替加環(huán)素是目前治療此類細(xì)菌感染的主流選擇，大部分菌株對(duì)其敏感率較高，但隨著該類抗菌藥物的大量應(yīng)用，多黏菌素耐藥基因（mcr）的出現(xiàn)使耐藥形勢(shì)更加嚴(yán)峻，目前已經(jīng)報(bào)道了同時(shí)攜帶blaNDM-1和mcr-1、blaNDM-1和mcr-4的陰溝腸桿菌[26]。同時(shí)也出現(xiàn)了對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株[27]，這些耐藥菌株的出現(xiàn)可能使得臨床治療陷入無(wú)藥可用的境地，隨之而來(lái)更大的挑戰(zhàn)就是如何控制耐藥菌的傳播。

3.2 耐藥傳播機(jī)制

耐藥菌不僅可以通過(guò)醫(yī)療器械、密切接觸等途徑在患者之間進(jìn)行傳播，也可以通過(guò)一些移動(dòng)遺傳元件（如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等）進(jìn)行耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，以及blaNDM-1基因的遺傳特征、攜帶blaNDM-1基因菌株的克隆背景等都可能導(dǎo)致耐藥性的廣泛播散。

3.2.1 質(zhì)粒（plasmid） 這是獨(dú)立于細(xì)菌染色體外能自我復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，可攜帶耐藥基因加速細(xì)菌耐藥性的傳播。陰溝腸桿菌攜帶的blaNDM-1基因大多位于質(zhì)粒上，其中以 Inc X3、Inc FII 、IncA /C2、IncFIA等幾種類型質(zhì)粒最常見，blaNDM-1基因通過(guò)各種不同類型質(zhì)粒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移傳播，并且某些型別的質(zhì)粒能在多種細(xì)菌中定植生存，從而大大加快了耐藥基因在同一菌種內(nèi)和不同菌種間傳播的速度[9,21]。

3.2.2 轉(zhuǎn)座子（transposon, Tn） Tn是基因組中可以從一個(gè)位點(diǎn)直接移動(dòng)到另一個(gè)位點(diǎn)的一段DNA序列。中國(guó)第一株攜帶blaNDM-1基因鮑曼不動(dòng)桿菌有完整的Tn125復(fù)合轉(zhuǎn)座子。賈曉炯[21]研究表明陰溝腸桿菌中blaNDM-1基因存在一段高度保守的序列，這部分序列不僅與中國(guó)分離的不動(dòng)桿菌Tn125復(fù)合轉(zhuǎn)座子序列相似，也與澳大利亞分離的攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌的序列非常相似[28]，表明這部分序列可能是導(dǎo)致blaNDM-1基因在不同菌種和地區(qū)間迅速傳播的原因之一。

3.2.3 整合子（integron） 它是一種運(yùn)動(dòng)性分子，可以捕獲外源性基因來(lái)增強(qiáng)細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的能力。一直以來(lái)，整合子被認(rèn)為是介導(dǎo)抗生素耐藥性擴(kuò)散、毒力以及致病性產(chǎn)生的重要移動(dòng)元件，但目前沒有研究表明整合子與blaNDM-1基因傳播之間存在確切關(guān)系[29]。

3.2.4 遺傳特征blaNDM-1基因的周圍環(huán)境對(duì)耐藥性傳播非常重要，盡管blaNDM-1的確切來(lái)源尚不確定，但blaNDM-1的遺傳背景具有兩個(gè)共同特征，其上游都有插入序列ISAba125元件或片段，博來(lái)霉素抗性基因bleMBL則始終位于下游[9]，提示blaNDM-1基因周圍高度保守的序列可能與其在不同菌種、地區(qū)間廣泛傳播有關(guān)。

3.2.5 克隆播散 目前對(duì)陰溝腸桿菌的克隆傳播知之甚少，研究顯示攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌呈遺傳、克隆多樣性，攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌的廣泛傳播不僅僅局限于某一種或數(shù)種特殊的克隆型別、ST 分型，不同國(guó)家和地區(qū)間的差異較大[2,4-6,13-15]。因此，與肺炎克雷伯菌ST258、ST11與blaKPC-2廣泛傳播之間的緊密關(guān)聯(lián)不同，陰溝腸桿菌的ST類型與blaNDM-1的高流行率、廣泛地理分布關(guān)系不大[2,9]。

4 致病機(jī)制與毒力

除了耐藥，毒力也是細(xì)菌的重要致病因素,在感染中發(fā)揮重要作用。細(xì)菌感染宿主需要經(jīng)歷多個(gè)過(guò)程，首先是菌毛黏附系統(tǒng)吸附宿主細(xì)胞并發(fā)生定植[30]。細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后分泌多種毒力因子以逃避免疫應(yīng)答，陰溝腸桿菌的生物膜具有外周屏障、抵抗藥物的作用，使其能夠成功避免被清除，導(dǎo)致持續(xù)性、反復(fù)性感染，是其重要毒力因子[31]。細(xì)菌定植后鐵攝取系統(tǒng)可以幫助細(xì)菌吸收鐵，從而增強(qiáng)細(xì)菌侵襲性感染的能力[32]；體外細(xì)胞試驗(yàn)表明陰溝腸桿菌的三型分泌系統(tǒng)能破壞吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，與細(xì)菌感染宿主后導(dǎo)致組織破壞、細(xì)菌擴(kuò)散，引起全身性感染密切相關(guān)；研究顯示AcrAB-TolC外排系統(tǒng)不僅參與陰溝腸桿菌的耐藥性，還與細(xì)菌的適應(yīng)性和毒力有關(guān)[33]。在感染過(guò)程中，陰溝腸桿菌能產(chǎn)生多種毒素介導(dǎo)細(xì)菌的致病性，如腸毒素、成孔細(xì)胞毒素、白細(xì)胞毒性細(xì)胞毒素、α溶血素、甘露糖敏感的血凝素等[34-36]，其致病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種毒力因子，在疾病發(fā)展中的作用機(jī)制目前仍不清楚。

通常情況下，細(xì)菌在獲得耐藥基因后，由于適應(yīng)性代價(jià)的原因，會(huì)導(dǎo)致毒力下降。但也有學(xué)者認(rèn)為NDM-1主要與細(xì)菌耐藥性有關(guān)，不會(huì)影響毒力及致病性[37]。Brust等[31]對(duì)產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌復(fù)合株進(jìn)行毒力相關(guān)研究，結(jié)果表明在霍氏腸桿菌不同亞群中，blaNDM-1基因的缺失會(huì)影響生物膜的產(chǎn)生能力，但對(duì)大蠟螟幼蟲的毒力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。趙金秋[38]通過(guò)體外生長(zhǎng)能力和體內(nèi)毒力試驗(yàn)證實(shí)blaNDM-1基因會(huì)使陰溝腸桿菌的繁殖能力及毒力增強(qiáng)。堯靜[39]通過(guò)構(gòu)建blaNDM-1基因敲除株與原始菌株進(jìn)行比較，結(jié)果表明攜帶blaNDM-1基因會(huì)使陰溝腸桿菌體外生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，但對(duì)生長(zhǎng)趨勢(shì)與生長(zhǎng)速度無(wú)影響。

綜上所述，陰溝腸桿菌本身具有多種復(fù)雜的毒力因素，blaNDM-1基因的獲得可能會(huì)對(duì)陰溝腸桿菌的致病性和毒力產(chǎn)生一定影響，但目前相關(guān)研究較少，還需要大量研究進(jìn)一步明確。

5 結(jié)語(yǔ)

盡管各衛(wèi)生保健機(jī)構(gòu)已經(jīng)作出了不懈努力，但攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌仍在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，此類細(xì)菌易于播散和多重耐藥的特性給公共健康帶來(lái)了極大威脅，對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，分析其耐藥機(jī)制、傳播途徑及致病機(jī)制，可為臨床治療與藥物研發(fā)提供幫助。除積極開發(fā)抗菌劑外，醫(yī)療機(jī)構(gòu)仍然需要加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格控制醫(yī)院感染，避免攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌的暴發(fā)流行。