基于網(wǎng)絡藥理學對四妙散治療高尿酸血癥主要活性成分及潛在靶點分析

葉文靜 林道斌 程亞偉 邱曉堂

廣州中醫(yī)藥大學附屬海南中醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南?？?570100

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）被廣泛認為是繼“三高”之后的第4 個重要的疾病危險因素[1]。據(jù)估計，我國沿海和經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)HUA 患病率在20%以上，已接近歐美發(fā)達國家水平。尿酸（UA）的升高，會導致痛風性關節(jié)炎、痛風腎病、心血管疾病的發(fā)生，并與肥胖、胰島素抵抗、高血壓發(fā)病等密切相關[2]。中藥具有作用多、靶點廣、副作用少的優(yōu)點，在HUA 的治療中具有很高的研究應用價值。四妙散來源于清代張秉成的《成方便讀》，由黃柏、薏仁、蒼術、牛膝構成?，F(xiàn)代中藥藥理研究表明，四妙散能夠抑制UA 合成酶XOD、XDH 活性，下調(diào)大鼠UA 轉(zhuǎn)運蛋白URAT1、GLUT9 表達，上調(diào)OAT1 表達而降低UA[3-4]。臨床治療方面，加味四妙散不僅能顯著降低UA，還能緩解全身癥狀，減少心血管事件發(fā)生[5-6]。目前對四妙散治療HUA 的作用機制研究大多是從單一成分或單一靶點進行的，這與多種成分、多個靶點的中藥治療本質(zhì)背道而馳。因此本研究使用網(wǎng)絡藥理學的研究方法，對四妙散治療HUA 進行系統(tǒng)性探討，為四妙散治療HUA 提供理論基礎及方法依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 四妙散有效成分收集與篩選

本研究以中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmspsearch.php）檢索關鍵詞“黃柏、蒼術、牛膝、薏苡仁”以獲得四妙散所有活性成分，并將篩選活性成分的條件設定為口服利用度（OB）≥30%和化合物類藥性（DL）≥0.18[7]。

1.2 藥物靶點的篩選與獲取

將藥物成分分子結(jié)構轉(zhuǎn)化為mol2 格式儲存，然后上傳至DRAR-CPI 數(shù)據(jù)庫（http://cpi.bio-x.cn/drar/）[8]。篩選靶點蛋白PDB ID，依據(jù)（Z-score）＜-1，最后導入Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uniprot/P0A0N5）得到靶點蛋白對應基因。

1.3 獲取疾病靶點與交集靶點

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），獲取HUA 疾病靶點，并與“1.1”項下篩選出的藥物靶點進行韋恩分析，得到交集靶點。

1.4 活性成分-靶點網(wǎng)絡的建立

為進一步分析藥物作用的機制，本研究將四妙散有效成分及其作用的HUA 靶點導入Cytoscape 3.6.1軟件建立網(wǎng)絡模型，得到活性成分-靶點關系圖，并依據(jù)網(wǎng)絡節(jié)點之間的連接數(shù)目進行分析。

1.5 四妙散治療HUA 的富集分析

將“1.3”項下獲取的交集靶點導入DAVID 工具（https://david.ncifcrf.gov/）進行基因本體（GO）、京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）分析，并使用Rx64 3.6.2將GO 分析結(jié)果及KEGG 結(jié)果制成可視化圖和高級氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 四妙散有效成分及靶點信息的篩選結(jié)果

經(jīng)TCMSP 平臺檢索，共獲得四妙散活性成分50 種，其中黃柏24 種、蒼術4 種、牛膝16 種、薏苡仁6 種，藥物靶點經(jīng)DRAR-CPI 平臺共檢索到288 個，去重后有36 個。

2.2 疾病靶點及四妙散治療HUA 靶點的篩選結(jié)果

經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索獲得471 個HUA 相關靶點，與TCMSP 平臺得到的藥物作用靶點進行韋恩分析，得到8 個治療HUA 的潛在靶點。見圖1。

2.3 活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡關系圖的構建

圖1 HUA 疾病靶點與藥物作用靶點韋恩分析圖

活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡關系圖中共有36 個節(jié)點，89 條邊。深色節(jié)點代表有效化合物，淺色節(jié)點代表潛在靶點。以度值（Degree）作為反映節(jié)點大小的依據(jù)，Degree 數(shù)值越大，節(jié)點越大。在活性成分方面，Degree 最高的活性成分分別為黃藤素（palmatine）10 個、豆甾醇（stigmasterol）9 個、小檗堿（berberine）8 個、黃連堿（coptisine）6 個、漢黃芩素（wogonin）6 個。在靶點方面，Degree 最高的靶點是前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、類視黃醇X 受體（RXR）、α 雌激素受體（ESR1）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3），分別對應35 種、17 種、15 種、11 種藥物活性成分。見圖2。

2.4 四妙散治療HUA 的富集分析結(jié)果

GO 分析根據(jù)閾值P ＜0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01 確定了26 條GO 富集分析條目，其中生物過程有16 條，分子功能有7 條，細胞成分有3 條，見表1。同時根據(jù)FDR＜0.01 找到了11 條作用通路，見表2。表1、表2 分別列舉了FDR 最小的GO 和KEGG 通路分析結(jié)果。

為了使作用通路進一步可視化，制作了GO 分析條形圖（圖3，封四）和KEGG 分析氣泡圖（圖4，封四）。如圖3 所示，四妙散在生物過程中對鈣離子轉(zhuǎn)運的負調(diào)控、雌二醇的反應作用較大；在分子成分中，對細胞膜作用較大，在分子功能上，對酶結(jié)合的作用較大。如圖4 所示，cGMP-PKG 信號通路所在P 值最小，基因數(shù)最多，表明四妙散對此通路影響最大，而對脂肪細胞中脂解調(diào)節(jié)通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、小細胞肺癌通路、雌激素信號通路的影響次之。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)了28 種四妙散治療HUA 的主要活性成分，Degree 最高的前兩種活性成分為黃藤素和豆甾醇。黃藤素主要成分為鹽酸巴馬汀，通過調(diào)節(jié)胰島素抵抗、抗氧化應激、抑菌消炎等生理功效發(fā)揮作用[9-10]。豆甾醇主要通過抗氧化、消炎、降脂、調(diào)節(jié)胰島素抵抗等發(fā)揮作用[11-13]。本研究推測黃藤素和豆甾醇可能通過降低胰島素抵抗、抗氧化應激、抑制炎癥、調(diào)節(jié)代謝紊亂等途徑對HUA 間接發(fā)揮效用。

圖2 活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡關系圖

圖3 活性成分靶點的GO分析條形圖(FDR<0.01)

圖4 四妙散治療HUA的靶點KEGG分析氣泡圖(FDR<0.01)

表1 活性成分靶點的GO 分析結(jié)果（FDR＜0.01）

表2 活性成分靶點的KEGG 分析結(jié)果（FDR＜0.01）

靶點方面，本研究發(fā)現(xiàn)了8 個治療HUA 的核心靶點，Degree 最高的靶點分別是PTGS2、RXRA、ESR1、NOS3。

前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）與PTGS2 合稱為環(huán)氧合酶（COX-1/2）。由于COX-1 在HUA 發(fā)病過程中鮮有報道，故研究集中在COX-2。COX-2 可誘導機體內(nèi)毒素、細胞因子、炎癥介質(zhì)等產(chǎn)生，并由內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及其他細胞釋放合成前列腺素（PG），進而產(chǎn)生發(fā)熱、疼痛和炎癥反應[14]。有研究顯示，UA 可通過血栓烷A2 引起血管平滑肌細胞增殖并上調(diào)其COX-2 mRNA 的表達，而選擇性的COX-2 抑制劑及血栓烷A2 拮抗劑可顯著降低UA[15]。此外，隨著UA 濃度的升高及代謝時間的延長，血管平滑肌細胞COX-2也隨之升高[16]。另有報道稱，沉積在關節(jié)中的尿酸鹽結(jié)晶能夠刺激COX-2 表達增加，尤其在痛風急性期，血清中COX-2 水平較慢性期明顯增高[17]。因此，四妙散可能通過作用于COX 靶點抑制炎癥反應，進而恢復UA 代謝平衡。

RXRA 與視黃酸受體（RAR）形成核受體家族[18]。RXR/RAR 的活化受視黃醇結(jié)合蛋白4 （RBP4） 的影響。由脂肪細胞分泌的RBP4 是一種小分子蛋白，主要在腎小管處重吸收[19]。高璐等[20]、Elizalde-Barrera 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HUA 患者血漿中RBP4 水平較不伴隨危險因素的高尿酸血癥患者顯著升高，血漿RBP4 與HUA 的發(fā)生中心環(huán)節(jié)主要是胰島素抵抗，胰島素抵抗會增加腎小管對鈉和UA 的重吸收，減少尿液中UA 的排泄，從而形成HUA。因此，四妙散作用于RXRA 靶點對改善胰島素抵抗，減少UA 排泄有積極作用。

雌激素受體是一種由ESR1 和β 雌激素受體（ESR2）調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)分子。Zeng 等[22]發(fā)現(xiàn)雌二醇通過結(jié)合ESR2 在轉(zhuǎn)錄后期下調(diào)GLUT9 表達，減少UA的重吸收。相關研究顯示，絕經(jīng)期女性UA 水平高于非絕經(jīng)期婦女，而雌二醇較其長期居于較低水平，二者間呈負相關[23]。據(jù)此，本研究推測四妙散可能通過補充體內(nèi)雌激素及作用于尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白降低UA。

一氧化氮（NO）具有舒張血管、抑制白細胞黏附及血小板聚集等特性，在血管生成及神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用，而NOS3 是NO 合成途徑中的關鍵限速酶[24]。有研究發(fā)現(xiàn)在胰島素抵抗狀態(tài)下，細胞內(nèi)活性氧大量增加，引發(fā)氧化應激反應，導致NO 失活，損害腎血管內(nèi)皮細胞，影響Na+運動，抑制UA 排泄[25]。Serizawa 等[26]發(fā)現(xiàn)抑制一氧化氮合酶活性及NOS3 氧化磷酸化的偶聯(lián)被破壞，可減輕胰島素抵抗引起的內(nèi)皮因子損傷。由此，說明四妙散作用于NO 靶點，可通過抑制炎癥反應、降低胰島素抵抗發(fā)揮作用。

此外，本研究還確定了11 條相關通路，如通路VEGF 是一種血管再生物質(zhì)，可促進內(nèi)皮細胞增殖、血管再生，改善腎缺血組織的側(cè)支循環(huán)及灌注，增加腎小球濾過率及UA 排泄[27-28]。雌激素信號通路異常通常與代謝性疾病的發(fā)生密切相關[29]。據(jù)報道，雌激素通過調(diào)節(jié)尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，或抑制XOD 系統(tǒng)，或通過減少肝臟脂肪堆積抑制戊糖磷酸途徑的活化，從而降低UA[30]。因此對相關通路的調(diào)控也是四妙散治療HUA 的關鍵步驟。