水蛭對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型法尼醇X 受體通路的調(diào)節(jié)作用

劉玉青 蔡 昕 覃仁武 王 瑤 羅 磊 楊 帆

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北武漢 430061；2.湖北省宜昌市中醫(yī)醫(yī)院感染科，湖北宜昌 443003；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科，湖北武漢 430060；4.三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院消化科，湖北宜昌 443000；5.湖北省中醫(yī)院肝病科，湖北武漢 430061

膽汁的生理流動(dòng)依賴于膽汁的合成、分泌及代謝過(guò)程中所有臟器組織和功能的完整性，當(dāng)這種完整性遭到各種病變破壞，使得膽汁不能正常進(jìn)入十二指腸，進(jìn)而進(jìn)入血液，從而出現(xiàn)膽汁淤積。目前在臨床上針對(duì)膽汁淤積的治療，主要是減輕癥狀和改善肝損傷，熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）和S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAMe）是目前較為常用的藥物[1]，但在臨床應(yīng)用上仍有一些不足[2-3]。因此，在探索治療肝內(nèi)膽汁淤積癥的有效且實(shí)用的藥物方面仍需進(jìn)行不斷的嘗試。近年來(lái)，有學(xué)者認(rèn)為慢性肝病的發(fā)展伴隨著肝絡(luò)的病變，肝藏血與疏理氣機(jī)的功能在肝絡(luò)的協(xié)調(diào)下才能進(jìn)行正常的生理活動(dòng)[4-5]，本研究選取逐瘀通絡(luò)藥代表藥水蛭作為實(shí)驗(yàn)用藥，旨在探討水蛭對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠的治療效果及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

水蛭顆粒劑，江陰天江制藥廠（批號(hào)：1606062）；UDCA，德國(guó)Losan Pharm 公司（批號(hào)：201305）；α-異硫氰酸萘酯 （ANIT） 購(gòu)自Sigma 試劑公司 （批號(hào)：STBC5577V）；PCR 試 劑 盒 購(gòu) 自TaKaRa 公 司（KR12 1221）；兔抗大鼠法尼醇X 受體（farnesoil X receptor，F(xiàn)XR）、小異源二聚體伴侶受體（small heterodimer chaperone receptor，SHP）、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移2B4（uridine diphosphate glucuronide transfer 2B4，UGT2B4）、膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、山羊抗兔二抗（ab73299、ab32159、aa68-96、AG019-1、SAB4500005、A12004-1）購(gòu)自CST公司。

1.2 動(dòng)物造模及給藥方法

選取8 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體重（200±20）g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2015-0018，合格證號(hào)：42009800 002732，購(gòu)自湖北省武漢市疾控中心。將40 只雄性SD 大鼠編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為：正常組、模型組、UDCA 組、水蛭高劑量組、水蛭低劑量組。除正常組和模型組外，UDCA 組給予60 mg/kg 的UDCA 溶液，水蛭高、低劑組給予50 mg/kg 和20 mg/kg 水蛭顆粒劑按5 mL/kg 體重連續(xù)灌胃7 d，1 次/d。正常組和模型組予以等量生理鹽水。在灌胃的第5 天，除正常組以外，其他各組大鼠予以100 mg/kg ANIT 造模，連續(xù)灌胃3 d，1 次/d。正常組予以等量生理鹽水。在末次給藥24 h后，腹腔注射水合利醛將大鼠麻醉，打開腹腔，取大鼠腹主動(dòng)脈血進(jìn)行血清學(xué)檢查，取大鼠肝臟組織進(jìn)行病理檢查及分子實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器

Aeroset 全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)雅培（Abbott）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）儀（Mx3000P）購(gòu)自美國(guó)Stratagene，電泳儀購(gòu)自國(guó)產(chǎn)GOLO（1653308）。

1.4 方法

1.4.1 血清學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹主動(dòng)脈取血，4℃，3000 r/min 離心10 min，離心半徑15 cm，取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)各組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBil）、總膽汁酸（TBA）水平。

1.4.2 肝臟組織HE 染色 取各組大鼠肝組織進(jìn)行組織脫水，組織透明，浸蠟，包埋，切片，烤片，脫蠟，切片入Mayey 蘇木精染色5 min，自來(lái)水洗浸洗返藍(lán)，無(wú)水乙醇及二甲苯?jīng)_洗5 min，風(fēng)干后中性樹膠封片，最后鏡檢。

1.4.3 RT-qPCR 法測(cè)定肝組織FXR、SHP、BSEP、UGT2B4 mRNA 的表達(dá) 將綠豆大小的大鼠肝臟組織按Trizol（日本TaKaRa 公司）說(shuō)明書提取組織總RNA，取適量RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在Applied Biosystems Stepone Real-Time PCR System 機(jī)器上進(jìn)行變性（30 s）、退火、延伸（3 min）。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃5 s；退火60℃20 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)。總反應(yīng)時(shí)間為1.5 h。RT-q PCR 反應(yīng)結(jié)果采用Stepone software 5.0 軟件進(jìn)行分析。采用2-△△Ct數(shù)值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1，并于PrimerBank 查找并用PubMed 驗(yàn)證。

表1 引物序列

1.4.4 Weste rn blot 法 檢 測(cè)FXR、SHP、UGT2B4、BSEP 蛋白的表達(dá) 取大鼠肝臟組織提取組織蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度行變性預(yù)處理。經(jīng)100 g/L SDSPAGE 分離膠電泳、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、免疫反應(yīng)抗體孵育一抗（抗磷酸甘油醛脫氫酶抗體（1∶5000）、抗FXR 抗體（1∶1000）、抗SHP抗體（1∶1000）、抗UGT2B4 抗體（1∶1000）、抗BSEP 抗體（1∶1000）過(guò)夜，隔天孵育二抗（1∶5000）、DAB 顯色液曝光，運(yùn)用Image J 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSDt 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、TBA、TBil 的水平比較

模型組血清ALT、AST、TBil、TBA 的水平高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；水蛭高劑量組血清ALT、AST、TBil 水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；水蛭高劑量組與模型組TBA水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；水蛭低劑量組血清AST、TBil、TBA 水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），水蛭低劑量組與模型組ALT水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；UDCA 組血清AST 的水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），UDCA 組與模型組ALT、TBA、TBil 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理表現(xiàn)

正常組大鼠肝臟切片中細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核圓大而清晰且肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠肝臟切片中可見灶狀壞死，肝細(xì)胞核皺縮，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，存在大量炎癥浸潤(rùn)；UDCA 組大鼠肝損傷稍有緩解，肝細(xì)胞核皺縮緩解，可見少量灶狀壞死，有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰；水蛭高劑量組大鼠肝損傷情況緩解，可見肝細(xì)胞壞死明顯減少，肝組織結(jié)構(gòu)較完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；水蛭低劑量組大鼠肝損傷較模型組有緩解，仍存在少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

2.3 各組大鼠肝組織FXR、SHP、BSEP、UGT2B4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

模型組FXR、SHP、BSEP、UGT2B4 mRNA 表達(dá)低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；水蛭高、低劑量組及UDCA 組FXR、SHP、BSEP、UGT2B4 mRNA 表達(dá)高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見圖3。

圖1 各組大鼠血清ALT、AST、TBA、TBil 的水平比較

圖2 各組大鼠肝臟組織HE 染色（200× ）

2.4 各組大鼠肝組織FXR、SHP、UGT2B4、BSEP 蛋白表達(dá)水平比較

模型組FXR、BSEP、UGT2B4、SHP 蛋白表達(dá)水平均低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；水蛭高、低劑量組FXR、BSEP、UGT2B4、SHP蛋白表達(dá)水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P ＜0.05），UDCA 組與模型組上述蛋白水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖4。

3 討論

在慢性肝病患者中，膽汁淤積的發(fā)生率較高[1]。藥物治療目的是改善由于膽汁淤積所致的臨床癥狀和肝臟損傷，主要的藥物有UDCA 和SAMe。目前還有一些在研究的藥物，比如奧貝膽酸（obeticholic acid OCA）和非諾貝特類藥物[6-7]，目前國(guó)外有研究將OCA進(jìn)行了臨床二期實(shí)驗(yàn)[8]，并取得了不錯(cuò)的療效。中醫(yī)理論中一直有“久病入絡(luò)”的說(shuō)法，病邪入體，易入肝血，進(jìn)而影響肝絡(luò)正常功能。水蛭作為蟲類通絡(luò)藥和逐瘀通絡(luò)藥的代表物，藥性善走竄，剔邪搜絡(luò)，作為蟲類活血藥更擅長(zhǎng)于走竄通達(dá)、疏逐搜剔，療效優(yōu)于植物類活血通絡(luò)藥[9-10]。水蛭味咸、苦，歸肝經(jīng)，因此可直達(dá)病所，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，水蛭所含水蛭素、肝素、抗血栓素，具有改善微循環(huán)、抗凝的功效，臨床可用于抗肝臟纖維化，治療肝脾腫大[11]。因此，本研究選用水蛭治療肝內(nèi)膽汁淤積，探討不同劑量水蛭溶液對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的作用及機(jī)制，為臨床應(yīng)用水蛭治療膽汁淤積提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖3 各組大鼠肝組織FXR、SHP、BSEP、UGT2B4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

圖4 各組大鼠肝組織FXR、SHP、UGT2B4、BSEP 蛋白表達(dá)水平比較

近年來(lái)有研究表明FXR 在膽汁淤積代謝中起關(guān)鍵作用[12]。FXR 在膽汁酸合成，解毒以及轉(zhuǎn)運(yùn)三個(gè)不同的方面均有其獨(dú)特的影響，在膽汁酸合成通路中，SHP 可抑制CYP7A1 轉(zhuǎn)錄，而后者是膽汁酸合成的限速酶[13-16]；在膽汁酸解毒通路中，UGT2B4 接受來(lái)自于FXR 的影響，下傳FXR 的解毒信號(hào)，較少受到其他信號(hào)的干擾[17-18]；而在膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，F(xiàn)XR 與BSEP基因啟動(dòng)子結(jié)合，可誘導(dǎo)膽小管細(xì)胞膜BSEP 表達(dá)，促進(jìn)膽汁酸分泌[19-22]。

本研究顯示，模型組大鼠血清ALT、AST、TBil、TBA 等指標(biāo)可出現(xiàn)明顯升高，膽管周圍出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)，肝細(xì)胞部分水腫壞死，提示ANIT 造模成功。本研究使用UDCA 作為陽(yáng)性對(duì)照藥，結(jié)果顯示大鼠肝臟中FXR 及下游因子蛋白表達(dá)較模型組顯著上調(diào)，但與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），可能UDCA對(duì)膽汁淤積的改善是通過(guò)親水性的、有細(xì)胞保護(hù)作用的UDCA 來(lái)相對(duì)替代親脂性的毒性膽汁酸，以及促進(jìn)肝細(xì)胞的分泌作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。與模型組比較，水蛭高、低劑量組大鼠肝臟組織的損傷減輕，血清中ALT、AST、TBil、TBA 的水平降低，各組FXR 及下游SHP、UGT2B4、BSEP 的mRNA 及蛋白表達(dá)均增加，水蛭高、低劑量組可以降低ANIT 所導(dǎo)致的肝臟損傷程度，減少肝細(xì)胞變性壞死，其可能的機(jī)制為介導(dǎo)FXR-SHP、FXR-BSER、FXR-UGT2B4 信號(hào)通路，從而調(diào)控膽汁酸的合成、代謝及解毒過(guò)程，從而改善膽汁淤積。

從中藥中發(fā)現(xiàn)抗膽汁淤積的活性物質(zhì)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。有研究表明，在傳統(tǒng)中藥的提取物如京尼平苷[23]、白藜蘆醇[24]、澤瀉醇B 醋酸酯[25]對(duì)膽汁淤積有治療作用。今后，本課題組可以對(duì)水蛭中的有效成分進(jìn)行進(jìn)一步明確，為其對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積癥的作用和機(jī)制提供更為詳實(shí)的資料和數(shù)據(jù)。