牛奶中布魯氏菌檢測技術(shù)研究進展

楊榮榮 ，張立新 ，楊 帆 ，段進剛 ，阿不都熱依木·賽提 ，張志新 ，馬春江 *，韓 立

(1.新疆哈密市動物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000 2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

患布病的母畜在患病期間和流產(chǎn)后的很長時間內(nèi)，依然可以通過乳汁排菌[1]。布病對畜牧業(yè)的健康發(fā)展存在巨大威脅，布魯氏菌病(簡稱布病)是一種由布魯氏菌屬細菌感染引起的人畜共患病，危害較大。布魯氏菌(Brucella)是一種革蘭氏陰性細菌，可被它感染的宿主范圍很廣，它對外界的理化環(huán)境存在一定的抵抗力，人類食用被布魯氏菌污染的牛奶及奶制品會被感染，感染后嚴重威脅自身的生命康健，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都非常重視牛奶中布魯氏菌的檢測技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r。 布病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類動物疫病，被《中華人民共和國傳染病防治法》列為乙類傳染病，被《中華人民共和國動物防疫法》列為二類動物疫病[2]。

牛奶可給人類提供維持生命健康的必需膳食營養(yǎng)素，被稱為“最接近完美的食物”，同樣也是幼兒生長和發(fā)育的天然營養(yǎng)輔食，有“全價食品”的美譽[3]。 據(jù)統(tǒng)計全球牛奶年產(chǎn)量已達到6.95 億t，僅歐洲20 大乳制品企業(yè)就創(chuàng)造了1 170 億歐元的年銷售額。 隨著人們對健康營養(yǎng)和美味的關(guān)注度上升，生乳及其制品也越來越受到消費者的歡迎[4]，然而被布魯氏菌污染的奶及奶制品不僅給人類生命健康帶來巨大威脅而且也給畜牧業(yè)和食品行業(yè)健康發(fā)展造成巨大阻力。因此建立一種快速、簡便、敏感、特異性強、生物安全水平高的牛奶中布魯氏菌檢測方法，對從源頭上確保牛奶的質(zhì)量安全、控制牛奶污染引發(fā)的人畜共患病意義重大，此法采奶樣檢測，避免了采血，對牛機體幾乎不產(chǎn)生刺激，不會減少大群奶牛的泌乳量，奶牛養(yǎng)殖戶樂意接納，此外利用檢測結(jié)果可溯源奶牛養(yǎng)殖場(戶)，為布病防控提供新的途徑和方法。

1 布魯氏菌病的危害

患布病的病畜和感染者(包括野生動物)是布魯氏菌的主要傳染源，患病母畜流產(chǎn)后會大量排菌，其流產(chǎn)物和產(chǎn)后陰道分泌物中含有大量布魯氏菌，極易形成氣溶膠污染環(huán)境引發(fā)人畜感染；若人類食用含病原菌的病畜肌肉、內(nèi)臟和乳汁也會引起布病感染[5]。 母畜感染布魯氏菌患病后的臨床癥狀主要有流產(chǎn)、死胎或弱胎、早產(chǎn)、胎盤滯留、產(chǎn)奶量下降、關(guān)節(jié)炎、滑囊炎等。 公畜感染布魯氏菌患病后的臨床癥狀主要有睪丸炎、副睪炎、后肢麻痹導(dǎo)致運動障礙等[6]。 人感染布魯氏菌患病后的臨床癥狀主要有發(fā)熱、寒顫、盜汗、關(guān)節(jié)痛、肌肉痙攣、睪丸發(fā)炎等，也存在導(dǎo)致不孕不育、流產(chǎn)的，容易反復(fù)發(fā)作，晚期患者較難治愈，久病者會喪失勞動能力，嚴重者會導(dǎo)致死亡[7]。目前，布病已蔓延至世界六大洲170 多個國家和地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計被布病威脅的人口約占世界的1/5～1/6[8]。 此外，布魯氏菌在環(huán)境中具有較強的存活能力并易形成氣溶膠，不法分子會利用這種特點制造生物戰(zhàn)劑和恐怖事件。布病的存在不僅威脅人類及動物的生命健康而且對我國的經(jīng)濟建設(shè)、國家安全產(chǎn)生嚴重威脅，可見布病的防控工作意義重大。

2 牛奶中布魯氏菌檢測技術(shù)的研究現(xiàn)狀

2.1 病原學(xué)檢測（Etiological detection）

目前診斷布病的金標準是對布魯氏菌進行分離培養(yǎng)、鑒定[9]。在實際應(yīng)用時可以在奶樣、全血、組織和拭子中分離出布魯氏菌，但易受動物感染階段、奶樣中病原體數(shù)量等因素影響，此外布魯氏菌生長條件苛刻且培養(yǎng)周期較長，最長可達45 d，最短也需要3～8 d[10]。 采用病原學(xué)方法檢測布魯氏菌需要與其直接接觸，因其對人有較高的致病性，檢測人員存在較大的感染風(fēng)險。目前國內(nèi)布魯氏菌的分離培養(yǎng)與檢測要求由接受過專業(yè)生物安全培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員在Ⅲ級生物安全實驗室進行，但仍存在病菌從實驗室擴散的風(fēng)險[11]。李積林[12]報道對MRT 檢測四個+以上的牛奶進行布魯氏菌分離培養(yǎng)和鑒定，雖然檢出率較高但工作量大培養(yǎng)時間長達8 d。 徐春志等[13]報道通過對疑似布病奶牛的牛奶進行布魯氏菌的培養(yǎng)、鑒別，對染色鏡檢陽性菌落進行PCR 檢測，成功分離出布魯氏菌屬，但該方法要求在Ⅲ級生物安全實驗室進行，培養(yǎng)時間長達12 d，不便于普查應(yīng)用。病原學(xué)分離培養(yǎng)、鑒定技術(shù)可靠、準確，且可以對布魯氏菌的各種生物型進行鑒定，現(xiàn)已有商品化的布魯氏菌血清培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基可供使用，能簡化實驗操作，但培養(yǎng)時間和生物安全性問題依然是攻克難點，此法不適用于布魯氏菌的臨床疫情篩查及快速檢測普查。

2.2 血清學(xué)檢測

2.2.1 全乳環(huán)狀實驗（Protocol of milk ring test，MRT）

MRT 主要用于篩查牛奶樣本中的布魯氏菌。該方法簡便快捷，檢測成本低，具有廣泛的應(yīng)用前景。它可以用于單個牛奶樣品以及奶罐混合奶樣的檢測，可避免采血的不便，對母牛機體幾乎不產(chǎn)生刺激，并且不影響奶牛的正常產(chǎn)奶量，養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)人都樂于接受，目前此法多用于大型奶牛場的現(xiàn)場篩查[14]。 臧鵬偉等[15]認為全乳環(huán)狀試驗(MRT)可用于檢測奶牛布魯氏菌，MRT 方法敏感性高、特異性強、簡單快速、易操作、 可靠準確， 在基層布病檢疫中具有廣泛的適用性， 可替代試管凝集試驗以及虎紅平板凝集試驗。MRT 方法的推廣試驗表明此法可對個體奶樣和混合奶樣進行檢測，適用大規(guī)模例行檢疫，可快速、經(jīng)濟地對特定的牛群或地區(qū)進行篩查，但酸敗的奶樣會檢出可疑和假陽性。 MRT 法靈敏度不夠高，對于牛初乳、近干奶期奶牛的乳樣、患乳房炎奶牛的乳樣、免疫后不到四個月的奶牛乳樣、發(fā)情期奶牛的乳樣進行檢測時均可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 在實際操作中限制條件較多，凍結(jié)牛奶、加熱或劇烈震蕩的牛奶、變質(zhì)牛奶、高溫季節(jié)送樣時間超過3 h 的奶樣都會影響檢測結(jié)果，因此不易廣泛推廣使用[16]。OIE 規(guī)定MRT 僅可用于奶牛檢測。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ Enzyme-linked immuonsorbant assay，ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附實驗分為間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(I-ELISA)和競爭酶聯(lián)免疫吸附實驗(C-ELISA)，目前已有報道用于檢測血清、牛乳樣本中的布魯氏菌。牛奶I-ELISA 方法也越來越多，商品化試劑盒的應(yīng)用也逐漸增多，在檢測過程中奶樣基本不用稀釋，而血清需多倍稀釋。 趙智香等人[17]將Milk-I-ELISA 方法同MRT 方法進行比較發(fā)現(xiàn)其敏感性、特異性均比MRT 高。 李彥偉等[18]在大批量檢測奶牛奶樣的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)可采用Milk-I-ELISA 對樣品進行初篩后對陽性樣品再采用C-ELISA 進行復(fù)核，可有效剔除初篩中的假陽性樣品，提高診斷的準確性。 I-ELISA 法不能區(qū)分野毒感染和S19 疫苗感染產(chǎn)生的抗體，故主要做篩查方法而不推薦做為確認方法運用，C-ELISA 使用MAb 檢測時特異性比I-ELISA 更高， 做確認方法更適合。 由于M-I-ELISA 方法對布病的檢測較敏感，因此在篩查感染布病乳牛群時可用于普查，李彥偉的模擬實驗表明M-I-ELISA 方法對儲存500 頭奶牛牛奶的奶罐中采集的奶樣進行檢測，可檢出存在一頭弱陽性布病牛牛奶中的布魯氏菌，實際檢測結(jié)果表明混樣檢測和血清檢測結(jié)果一致，因此在篩查感染布病乳牛群時可用于普查，適用大批量檢測奶牛奶樣，為提高準確性，有效剔除初篩中的假陽性樣品，可采用Milk-I-ELISA 法對奶樣進行初篩后的陽性樣品再采用C-ELISA 進行復(fù)核，但此法是不適用檢測近干奶期和妊娠后期的奶牛奶樣。 ELISA 方法具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，可用作布病的篩查和診斷，目前市面上可獲得幾種不同的商品化試劑盒，但ELISA 方法也存在檢測成本較高、耗時較長、且需要在國家生物二級及以上實驗室內(nèi)采用酶標儀等儀器設(shè)備進行檢測，因此對于基層和現(xiàn)場快速檢測來說不易推廣[19]。

2.2.3 膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatography，GICA）

免疫層析技術(shù)是一種新型的免疫分析技術(shù)，出現(xiàn)在1980 年代初期[20]。 斑點免疫金滲濾試驗和膠體金免疫層析法是膠體金免疫層析技術(shù)的主要分類。由于膠體金標記技術(shù)獨特的優(yōu)勢廣大學(xué)者在布魯氏菌血清學(xué)檢測領(lǐng)域進行了廣泛的研究和應(yīng)用[21]。 目前已有國產(chǎn)和進口的膠體金標快速檢測卡上市，可用于牛奶中布魯氏菌的快速檢測篩查。此外，養(yǎng)殖場(企業(yè))也可使用膠體金試紙開展自檢工作，這將有助于及時準確地檢測到潛在感染的母牛。 膠體金試紙條具有價格低廉，操作簡便，無需專用設(shè)備，不需要專業(yè)技術(shù)人員操作等優(yōu)點，是一種比較受歡迎的檢測方法。在基層工作人員進行布病的診斷，流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場應(yīng)用中適于推廣[22]。 肖妍等[23]建立了一種免疫層析法檢測牛奶樣品中的布魯氏菌抗體，試紙條的靈敏度為98.0%，特異性為96.0%，批間、批內(nèi)重復(fù)性均良好，但有假陽性出現(xiàn)。 奚德華等[24]應(yīng)用全乳ELISA，血清ELISA 試劑盒和膠體金試劑條檢測牛布魯氏菌，對膠體金和血清ELISA 試驗檢測結(jié)果進行對比，得出膠體金方法的敏感性和特異性分別為83.33%和99.89%， 凍融次數(shù)在2 次以內(nèi)的奶樣進行檢測不影響結(jié)果的判定，但伴隨凍融次數(shù)增加，陽性檢出率出現(xiàn)逐漸降低趨勢，保存在4 ℃的乳樣在5 d 以內(nèi)的檢測結(jié)果一致，但隨著不斷增加保存天數(shù)，陽性檢出率呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。 因此探索建立一種特異、靈敏、簡單、經(jīng)濟可靠的膠體金免疫層析方法對牛奶中的布魯氏菌進行初篩，利于基層大批量篩查，對從源頭控制鮮奶奶源質(zhì)量安全以及養(yǎng)殖場布病的檢疫都非常重要。

2.3 PCR 檢測技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測技術(shù)是隨著近些年分子生物學(xué)的快速發(fā)展基于體外酶促擴增DNA 的新技術(shù)，具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等優(yōu)點。 與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測、血清學(xué)檢測不同的是PCR 技術(shù)可以檢測少量布魯氏菌的核酸就可以達到檢測的目的。 該方法能快速確定布魯氏菌的種屬，使得種間的生物型鑒定成為可能[25]。 Feketeetal[26]等1990 年首次使用PCR 方法檢測布魯氏菌的抗原。 到1995 年和1996 年有專家開始探索采用PCR 技術(shù)對人畜布病進行檢測診斷。 李彥偉等[18]使用OIE 標準布魯氏菌ELISA 檢測方法驗證了不增菌直擴的單重PCR 檢測方法具有特異性好、靈敏性高的優(yōu)點，此法以BCSP31 基因和IS711 基因設(shè)計引物，應(yīng)用于牛奶中布魯氏菌檢測時表現(xiàn)優(yōu)異。 杜琳等[27]通過對PCR 檢測技術(shù)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行優(yōu)化，以布魯氏菌Omp31 和Omp25 基因設(shè)計引物，建立的布魯氏菌多重PCR 檢測方法用于牛奶檢測，此法特異、敏感、簡單快速。 SN/T1942.2-2007 檢驗方法第2 部分使用肉湯增菌后PCR 方法快速檢測動物源性食品中的布魯氏菌，存在生物安全隱患[28]。 易新萍、鐘旗等人[29]對牛奶采取平皿增菌后進行布魯氏菌的PCR 檢測，NY/T 1467-2007 標準采用未增菌直擴法， 以O(shè)mp25 基因設(shè)計引物進行牛奶中的布菌的PCR 檢測[30]。 PCR 技術(shù)也可對冷凍奶樣進行檢測，隨著科技進步，PCR 檢測技術(shù)的應(yīng)用也越來越廣泛，不增菌直擴法的PCR 技術(shù)、可測布魯氏菌和結(jié)核桿菌的二重PCR 方法以及多重PCR 方法都可以用于牛奶中布病的檢測，不僅可以降低實驗室操作人員感染風(fēng)險，還能鑒別布魯氏菌型。 因此探索建立一種敏感、特異性強、操作步驟簡單、不增菌的PCR 方法對牛奶中的布魯氏菌的檢測、鑒定都具有重要意義，對社會公共安全、食品安全和布病防控均具有長遠意義。

3 展 望

目前，世界范圍內(nèi)用于檢測牛奶中布魯氏菌的方法主要包括血清學(xué)診斷法、病原體的分離培養(yǎng)鑒定方法、MRT 法、ELISA 方法和PCR 檢測法。 每種方法都有各自的優(yōu)缺點，至今，還沒有找到可以適用于任何情況下進行快速準確檢測布病的單一方法。筆者認為縣市及以上機構(gòu)在布病疫情防控選擇方法時應(yīng)綜合考慮檢測目的、檢測環(huán)境條件、經(jīng)濟等因素，選擇最佳組合方法滿足市、縣、鄉(xiāng)三級防控體系。 建議探索建立一種特異性強、敏感性高、簡便、快速、經(jīng)濟的牛奶中布魯氏菌檢測的膠體金試紙條方法應(yīng)用于大批量樣品篩查，可免去對奶牛進行采血，適用于鄉(xiāng)鎮(zhèn)等基層進行快速篩查?？h市機構(gòu)可根據(jù)實驗室條件選擇ELISA 方法和PCR 技術(shù)等具有高特異性、 強靈敏度的方法進行篩查確認或?qū)Τ鹾Y陽性樣品進行復(fù)檢確認。 當(dāng)前畜間常用的結(jié)核病檢測方法是皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ 干擾素檢測方法，前者檢測成本較低但監(jiān)測耗時長最長可達5 d，后者檢測效率高但試劑盒價格較高。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展進步，PCR 在布魯氏菌及結(jié)核桿菌的檢測、鑒定方面越來越受到重視，逐漸被廣泛應(yīng)用。筆者認為探索建立一種可同時檢測牛奶中布魯氏菌和結(jié)核桿菌的特異、敏感、簡便且不進行增菌的多重PCR 方法，不僅可以達到快速診斷“兩病檢測”的目的，而且可以降低實驗室環(huán)境和操作人員的感染風(fēng)險。 在實際應(yīng)用中通過對比各種方法優(yōu)劣，科學(xué)組合，以期能最大程度的減小實驗誤差，同時經(jīng)濟操作性強，大大提高檢測效率，還能及時發(fā)現(xiàn)牛奶中的風(fēng)險因子，對于從源頭上保證乳產(chǎn)品的質(zhì)量安全、控制乳產(chǎn)品污染引發(fā)的人畜共患病、消除布魯氏菌和結(jié)核桿菌的風(fēng)險因子和預(yù)防控制都具有深遠意義。探索準確、快速、特異性強、生物安全水平高、高效的檢測方法對牛奶中布魯氏菌和結(jié)核桿菌進行檢測，不僅是現(xiàn)代食品安全和公共衛(wèi)生領(lǐng)域需要重點突破的難題，也可為布病和結(jié)核病的防控和凈化提供良好補充。