灘羊羊毛與毛囊發(fā)育相關(guān)生物學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展

馬麗娜，于 洋，馬 青

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川750002）

灘羊是寧夏回族自治區(qū)主養(yǎng)品種，是國家二級(jí)保護(hù)地方優(yōu)良品種，是一種獨(dú)特的裘皮用綿羊品種。對(duì)灘羊品種特性的研究大多關(guān)注利用傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法理論及生命體形態(tài)發(fā)生學(xué)分析裘皮形成的主要影響因素，以及如何進(jìn)一步進(jìn)行對(duì)灘羊品種進(jìn)行合理利用及品種保護(hù)等，而對(duì)灘羊卷曲毛發(fā)表型的研究鮮少。隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展，對(duì)灘羊毛發(fā)卷曲特性的研究逐漸從傳統(tǒng)遺傳學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)閱蝹€(gè)基因?qū)υ撔誀畹挠绊懀ㄟ^分析某個(gè)基因或多個(gè)基因的多態(tài)性，研究該基因與其調(diào)控性狀之間的關(guān)聯(lián)性。

1 灘羊裘皮特征

灘羊裘皮，又名二毛皮，是指羔羊出生后約35 d屠宰所得的皮張。此時(shí)，毛股長(zhǎng)約7 cm，毛股的彎曲數(shù)達(dá)到5個(gè)以上，波浪狀，自然彎曲下垂[1]。灘羊裘皮具有潔白如玉、晶瑩剔透的外觀、良好的柔軟性以及保暖性。

灘羊毛屬于異質(zhì)毛，被毛由有髓毛、無髓毛、兩型毛組成，還有極少部分羊含有少量干死毛[2]。灘羊不同時(shí)期被毛的類型不同，初生期時(shí)灘羊被毛為兩型毛，毛長(zhǎng)約4.5 cm，毛短而彎曲。而到35 d后的二毛時(shí)期，絨毛長(zhǎng)出皮膚，被毛的類型由絨毛和兩型毛組成，此時(shí)毛長(zhǎng)約7 cm，毛股的彎曲達(dá)到5～6個(gè)以上[3]。二毛裘皮根據(jù)不同比例的被毛類型形成不同類型的圖案，根據(jù)圖案的類型將灘羊裘皮分為軟大花型、串子花型、綠豆絲花型。其中，綠豆絲花型絨毛含量最少（30%～40%），串子花型次之（50%左右），軟大花型絨毛含量最多（60%以上）[4]。

2 羊皮膚結(jié)構(gòu)

羊的皮膚對(duì)保護(hù)體內(nèi)器官組織不受到外部環(huán)境破壞以及保持體內(nèi)水分的平衡具有重要作用[5]。羊的皮膚內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)從外到里由羊的表皮、真皮以及皮下結(jié)締組織三部分組成。羊的表皮由生發(fā)層和表皮層兩部分組成。真皮層主要由毛囊層和真皮下的網(wǎng)狀層兩個(gè)大部分組織構(gòu)成。真皮下分布著具有疏松的結(jié)締組織，毛囊層實(shí)際上就是疏松的結(jié)締組織，是由毛囊以及皮脂腺、汗腺等毛囊附屬結(jié)構(gòu)組成[5]。毛囊是一個(gè)形狀類似于口袋狀的組織結(jié)構(gòu)[6]，從外到內(nèi)依次由外根鞘（outerrootsheath，ORS）、伴侶層（companionlayer）、內(nèi)根鞘（innerrootsheath，IRS）與毛干（hairshaft）構(gòu)成。其中，外皮、皮質(zhì)、髓質(zhì)組成了毛干結(jié)構(gòu)。而赫胥黎層（huxleylayer）、亨勒層（henlenslayer）以及內(nèi)根鞘外皮構(gòu)成一個(gè)完整的內(nèi)根鞘結(jié)構(gòu)。內(nèi)根鞘包圍毛干，是決定毛干的生長(zhǎng)與分化所必需的結(jié)構(gòu)[7]。毛球內(nèi)部里面包含著稠密的真皮纖維細(xì)胞，它們內(nèi)陷深入形成一個(gè)口袋狀的結(jié)構(gòu)，稱之為毛乳頭（dermalpapilla，DP）。毛乳頭是一個(gè)高度特殊的結(jié)構(gòu)，是毛囊發(fā)育調(diào)控的中心結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)信號(hào)的發(fā)送與接收[8-9]。毛乳頭是由存在于毛囊基底部的真皮源性細(xì)胞（即真皮毛乳頭細(xì)胞）組成[10]，在有關(guān)毛發(fā)毛囊的形成以及毛囊發(fā)育的周期循環(huán)中具有關(guān)鍵的作用。依據(jù)毛囊的形態(tài)和結(jié)構(gòu)可以將其分成初級(jí)毛囊、次級(jí)毛囊兩類。一般羊的初級(jí)毛囊形成于胎兒時(shí)期60～85 d，初級(jí)毛囊數(shù)目較少，結(jié)構(gòu)上初級(jí)毛囊直徑較大，具有2個(gè)皮脂腺、汗腺以及立毛肌等完整的毛囊附屬結(jié)構(gòu)；而羊的次級(jí)毛囊形成于胎兒時(shí)期75～115 d，次級(jí)毛囊數(shù)目較多，而在結(jié)構(gòu)上直徑較小，不具有完整的毛囊屬結(jié)構(gòu)，有且僅有一個(gè)皮脂腺，并且次級(jí)毛囊多數(shù)圍繞初級(jí)毛囊分布[11-12]。

毛囊毛纖維的發(fā)育與毛囊的生長(zhǎng)息息相關(guān)，毛囊各部分角蛋白基因表達(dá)各不相同，有著復(fù)雜的生物學(xué)過程[13]。毛囊也是一個(gè)高度循環(huán)的結(jié)構(gòu)，由毛球的生長(zhǎng)與衰退控制，主要分為3個(gè)時(shí)期，毛發(fā)生長(zhǎng)早期（anagen，生長(zhǎng)期）、毛發(fā)生長(zhǎng)中期（catagen，退行期）和毛發(fā)生長(zhǎng)晚期（telogen，休止期）。在毛發(fā)生長(zhǎng)的不同周期，毛發(fā)特異性角蛋白表達(dá)不同，影響毛纖維生長(zhǎng)發(fā)育和纖維性狀。毛囊是調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)的皮膚附屬器官，對(duì)于毛發(fā)彎曲形狀的形成具有重要作用[14]。毛囊是一種特定的微型器官，具有周期性生長(zhǎng)的能力，是組織再生研究的有效模型。毛發(fā)的形狀、類型和顏色等性狀不僅在胚胎發(fā)生期間確定，而且在每個(gè)毛發(fā)生長(zhǎng)周期中重復(fù)確定。灘羊二毛皮特性是在灘羊生長(zhǎng)發(fā)育的特殊時(shí)期（出生到30 d）表現(xiàn)的性狀，在灘羊胚胎期已被奠定，其形成可能與胚胎期毛囊與毛纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及其調(diào)控有關(guān)[15]。趙正偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，軟大花羔羊毛纖維鱗片結(jié)構(gòu)與山羊絨相似，保暖性優(yōu)于串子花羔羊毛，抗粘連性較串子花羔羊差，二毛期灘羊的增重與毛股彎曲數(shù)呈負(fù)相關(guān)；串子花羔羊毛纖維強(qiáng)度優(yōu)于軟大花羔羊。楊佐青[6]應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對(duì)灘羊、內(nèi)蒙古蘇尼特羊、中衛(wèi)山羊和新吉細(xì)毛羊的皮膚蛋白進(jìn)行差異表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)K34和K83可能與灘羊羊毛粗細(xì)及彎曲度呈相關(guān)性。牛姝等[17]研究發(fā)現(xiàn)，KRT71基因在毛囊內(nèi)根鞘特異表達(dá)，并且在綿羊不同部位毛發(fā)彎曲與基因表達(dá)量呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明KRT71基因的表達(dá)與毛發(fā)彎曲相關(guān)。李向龍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，灘羊初生期側(cè)部彎曲數(shù)與初生期側(cè)部毛長(zhǎng)、二毛期側(cè)部彎曲數(shù)間均存在極顯著正相關(guān)；二毛期側(cè)部毛長(zhǎng)與側(cè)部彎曲數(shù)呈極顯著正相關(guān)。兩型毛、絨毛的毛纖維直徑標(biāo)準(zhǔn)差（FDSD）與毛纖維直徑變異系數(shù)（CVFD）間均呈極顯著強(qiáng)正相關(guān)；兩型毛絨毛的平均纖維直徑（MFD）與FDSD均呈極顯著正相關(guān)；絨毛MFD與絨毛CVFD呈極顯著正相關(guān)；絨毛MFD和平均纖維曲率（MFC）間呈極顯著負(fù)相關(guān)。白玲榮等[19]建立及優(yōu)化了灘羊羊毛蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜體系，為后續(xù)灘羊羊毛的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究建立條件。趙國順等[20]建議融合蛋白質(zhì)組、基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等的組學(xué)，將從整體的角度研究組織器官功能和代謝的狀態(tài)。路立里等[21]發(fā)現(xiàn)，羊毛彎曲與毛囊中細(xì)胞的不對(duì)稱分裂、毛纖維中正副皮質(zhì)的雙邊排列、不同角蛋白的不對(duì)稱組成及角質(zhì)化過程等相關(guān)。楊佐青等[22]通過雙向電泳技術(shù)獲得較高分辨率的灘羊4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期皮膚雙向電泳圖譜，共獲取19個(gè)差異蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜成功鑒定出15個(gè)蛋白點(diǎn)，其中發(fā)現(xiàn)1號(hào)、3號(hào)和10號(hào)點(diǎn)的14-3-3蛋白σ亞型、9號(hào)點(diǎn)為膜聯(lián)蛋白A2、16號(hào)點(diǎn)為角蛋白25、18號(hào)點(diǎn)為微管蛋白α鏈，可能與灘羊皮膚生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)。楊佐青等[23]通過iTARQ技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古蘇尼特羊、中衛(wèi)山羊和新吉細(xì)毛羊分別與灘羊皮膚蛋白比對(duì)獲得的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，推測(cè)出14-3-3蛋白σ亞型在灘羊進(jìn)化過程中與其二毛裘皮形成具有一定的關(guān)聯(lián)性，KRT25、KRT34和KRT85可能與灘羊毛股彎曲和特定花穗形狀的形成有關(guān)，TCHH在灘羊毛股彎曲的形成中具有重要的調(diào)控作用，KAP6和KAP11.1基因可能參與灘羊羊毛纖維直徑調(diào)控。李亞超等[24]采用iTRAQ技術(shù)及LC-MS/MS的研究方法，對(duì)初生期和二毛期串子花型灘羊的皮膚樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和篩選，發(fā)現(xiàn)初生期與二毛期裘皮共檢出2 599個(gè)蛋白，其中初生期65個(gè)差異蛋白高表達(dá)，二毛期有122個(gè)差異蛋白高表達(dá)；發(fā)現(xiàn)HSPA4L蛋白可能對(duì)灘羊串子花型裘皮二毛期毛發(fā)的彎曲程度有一定的作用；ApoA1可能在灘羊串子花型裘皮二毛期毛囊的發(fā)育以及羊毛的彎曲形成中起到重要作用；GF-1因子可能與灘羊串子花型裘皮二毛期毛囊及毛干的快速發(fā)育相關(guān)。陳永宏等[25]采用iTRAQ技術(shù)及LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，對(duì)串子花型、軟大花型、綠豆絲型及其他不規(guī)則形花穗裘皮蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和篩選，4類花穗型裘皮共檢測(cè)出2 886個(gè)蛋白，其中有135、142、113個(gè)差異蛋白分別存在于軟大花型與串子花型、綠豆絲型與串子花型、其他不規(guī)則形與串子花型3個(gè)對(duì)比組中。對(duì)有表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可能與軟大花型毛股形成相關(guān)，KAP3和KAP6可能與灘羊串子花型毛股結(jié)構(gòu)相關(guān)。和東遷等[26]研究發(fā)現(xiàn)，羊毛的性狀受多種因素的影響，如基因的變異、編碼蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性或者蛋白翻譯后修飾以及外部因素的影響等。

3 羊皮膚轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

隨著RNA-seq技術(shù)在生命科學(xué)的不同領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用，皮膚轉(zhuǎn)錄組層面已經(jīng)廣泛的使用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行科學(xué)研究。但是，國內(nèi)外對(duì)于動(dòng)物皮膚轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究?jī)?nèi)容涉及的相對(duì)較少。Yue等[27]使用IlluminaHiseq2000平臺(tái)對(duì)細(xì)毛羊皮膚進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共有22 164個(gè)功能基因被注釋，并將其歸類到25類218條信號(hào)通路中，其中與毛囊發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路有17條，為綿羊遺傳和功能基因組的研究提供良好的平臺(tái)。Nie等[28]利用以生產(chǎn)地毯毛的羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過對(duì)胎兒皮膚進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)全局性改變的lncRNA（上調(diào)36個(gè)，下調(diào)26個(gè)）、mRNAs（上調(diào)228個(gè)，下調(diào)225個(gè)）和80個(gè)表達(dá)差異的新轉(zhuǎn)錄本，通過功能富集后發(fā)現(xiàn)了WNT、EDAR、BMP等幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)和一系列的lncRNA對(duì)初級(jí)毛囊的誘導(dǎo)具有重要意義。Gao等[29]以克什米爾山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，用胎兒60、120 d、初生期的克什米爾絨山羊的皮膚進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在胎兒60 d與胎兒120 d轉(zhuǎn)換組內(nèi)篩選出1 024個(gè)差異基因，胎兒60 d與初生期轉(zhuǎn)換內(nèi)篩選出1 801個(gè)差異基因，胎兒120 d與初生期轉(zhuǎn)換期內(nèi)無顯著差異表達(dá)的基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Wnt、TGF-β和Notch家族的成員在毛囊的分化和成熟過程中具有重要作用。

Kang等[30]用RNA-seq技術(shù)對(duì)1月齡、48月齡灘羊皮膚共鑒定出51 215個(gè)轉(zhuǎn)錄本，對(duì)前100表達(dá)量高的轉(zhuǎn)錄本的通路分析表明，這些通路對(duì)毛發(fā)或絨毛的發(fā)育相關(guān)，篩選出600個(gè)差異表達(dá)基因，檢測(cè)到差異表達(dá)基因分別與信號(hào)、信號(hào)肽、二硫鍵、糖蛋白和分泌項(xiàng)有關(guān)，進(jìn)一步分析表明，金屬硫蛋白亞型3在灘羊皮膚中上調(diào)，提示其可能與中國灘羊卷毛的構(gòu)象有關(guān)。劉玉芳[31]利用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）在灘羊兩個(gè)生長(zhǎng)階段中共鑒定出67個(gè)差異表達(dá)基因，最終獲得20個(gè)（包括KRT71和KRT83）與毛發(fā)生長(zhǎng)相關(guān)基因。對(duì)差異miRNA進(jìn)行GO和KEGG分化其主要富集到MA信號(hào)通路與AMPK信號(hào)通路等與卷曲毛發(fā)生長(zhǎng)相關(guān)的通路。KRT71基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾是影響該基因在灘羊兩個(gè)時(shí)期的差異表達(dá)的重要調(diào)控方式；Mir432和cap1抑制KRT83基因的表達(dá)，可能是調(diào)控灘羊被毛卷曲形成的重要原因[31]。何玉龍等[32]等通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)成年灘羊和小尾寒羊皮膚毛囊中的miRNAs進(jìn)行分析，在灘羊與小尾寒羊中共篩選到63個(gè)上調(diào)和16個(gè)下調(diào)的差異miRNAs。通過對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)其靶基因主要參與細(xì)胞組分、代謝過程、細(xì)胞進(jìn)程催化活性等；而KEGG通路分析表明，在內(nèi)吞作用、糖酵解、糖異生和嘌呤代謝等信號(hào)通路上顯著富集。上述結(jié)果表明，在兩個(gè)品種的皮膚組織中篩選的差異miRNA可能通過調(diào)節(jié)其靶基因而參與調(diào)節(jié)羊皮毛囊發(fā)育的過程。

4 展望

由于目前科研工作者們?cè)跒┭螋闷さ难芯恐型度氲目蒲薪?jīng)歷尚不足，因此，有關(guān)灘羊裘皮性狀遺傳研究的相關(guān)報(bào)道還相對(duì)較少，需要進(jìn)一步的完善。

目前，未找到國內(nèi)外對(duì)于胚胎后期以及胎兒早期灘羊皮膚轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，期望本文對(duì)于灘羊皮膚毛囊發(fā)育轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供一定的參考價(jià)值。未來灘羊裘皮性狀研究可從以下2點(diǎn)入手：（1）針對(duì)我國灘羊二毛皮的獨(dú)特性，采用全基因組關(guān)聯(lián)分析和胚胎期轉(zhuǎn)錄表達(dá)組分析等組學(xué)技術(shù)，揭示二毛皮卷曲度密切相關(guān)的關(guān)鍵基因與變異；（2）結(jié)合胚胎期皮膚毛囊動(dòng)態(tài)發(fā)育過程，構(gòu)建二毛皮發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析二毛皮卷曲性狀形成機(jī)制，進(jìn)而較為全面的闡述二毛皮生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳機(jī)制，為優(yōu)質(zhì)灘羊的二毛皮性狀選育提供準(zhǔn)確可靠的分子育種標(biāo)記。未來，將會(huì)有更多影響羊毛彎曲、毛囊生長(zhǎng)發(fā)育因子及調(diào)控機(jī)制被發(fā)現(xiàn)和闡明，可為動(dòng)物種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供參考。