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    補腎法促干細胞歸巢在骨質(zhì)疏松中的應用

    2021-03-27 16:36:21余富勇余翔鄉(xiāng)曉嵐沈耿楊尚奇
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2021年11期
    關(guān)鍵詞:研究

    余富勇 余翔 鄉(xiāng)曉嵐 沈耿楊 尚奇

    陳文敏1 湯凱1,2 陳桂鋒1,2 王曉文1 江曉兵2* 任輝2*

    1.廣州中醫(yī)藥大學,廣東 廣州 510400 2.廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心,廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨病[1]。老齡化是OP的危險因素,我國已經(jīng)步入老齡化社會,且老齡人口依舊呈現(xiàn)增長趨勢,OP發(fā)病率隨之增長[2]。OP的治療消耗了家庭和社會的較大精力和財富。目前,防治OP的藥物并不能滿足當前的需求。干細胞療法是目前治療OP的一種新興療法,國內(nèi)外已有研究報道了干細胞移植可有效防治OP[3-4]。干細胞移植后,可歸巢到OP局部損傷區(qū)域,但目前干細胞移植后存在歸巢效率不佳的問題,從而限制了干細胞的治療效果,成為干細胞治療OP的瓶頸之一。

    因此,為提升干細胞移植治療OP的療效,提升干細胞歸巢效率具有不可忽視的重要意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn),補腎法能夠有效促進骨再生[5],補腎中藥和方劑在促進干細胞歸巢方面發(fā)揮著重要作用。因此,探究補腎法促干細胞歸巢在骨質(zhì)疏松中的應用具有重要意義。本文擬探討補腎法促干細胞歸巢在骨質(zhì)疏松中的應用前景。

    1 補腎法治療OP的中醫(yī)內(nèi)涵

    OP屬于中醫(yī)古籍所載的“骨痿”“骨枯”[6]?!端貑枴酚涊d:“腎者……精之處也……其充在骨”,《醫(yī)經(jīng)精義》云:“腎藏精,精生髓,髓養(yǎng)骨”,OP多由腎虛所致,腎精漸衰導致骨髓無力生化,骨量稀少,引發(fā)OP。因此OP的治療關(guān)鍵是補腎。中醫(yī)多從補腎陰、補腎陽治療OP?!端貑枴分刑岢觥瓣幵趦?nèi),陽之守也;陽在外,陰之使也”。陽化氣不足,骨髓無力生化,進一步使陰成形受損,致使骨質(zhì)形成功能降低,是“陰陽失衡”引發(fā)OP的重要過程。補腎法通過補充腎精激發(fā)“陽化氣”功能,進而改善“陰成形”能力促進骨再生,恢復丟失的骨量,治療OP。本文重點論述補腎法激發(fā)“陽化氣”功能階段的機制。

    2 干細胞的歸巢機制

    歸巢是一個協(xié)調(diào)的多步驟過程,包括滾動、內(nèi)皮細胞粘附及最終由選擇素和整合素介導的跨內(nèi)皮細胞遷移[7]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)最常用于OP的治療,其壁龕位于血管壁附近,骨小梁的內(nèi)表面,在纖維間隙內(nèi),少量存在于臍血、牙組織、滑液和肌肉中,因此可能從血流、骨髓、肌肉或骨膜中遷移[8]。目前,干細胞歸巢的機制并不明確。在歸巢的啟動研究方面,主要圍繞基質(zhì)細胞衍生因子(stromal cell derived factors,SDF-1)與CXCR4軸展開,遷移的過程與整合素及鈣粘蛋白密切相關(guān),遷移后的細胞行為也會對歸巢產(chǎn)生影響。

    2.1 干細胞歸巢與SDF-1/CXCR4軸

    干細胞的遷移通常由組織釋放的信號分子啟動,其中SDF-1/CXCR4備受關(guān)注。SDF-1與CXCR4的表達在一定程度上提示了干細胞的歸巢能力,且與年齡及OP密切相關(guān),年輕大鼠中的MSCs向SDF-1遷移的能力及CXCR-4的表達水平高于成年大鼠,顯著高于OVX大鼠[9-10]。Chen等[11]用熒光標記法在小鼠體內(nèi)輸注Aln-Lipo-SDF-1,生物光子成像顯示其在骨組織中積聚,且移植的GFP+MSCs被骨髓吸引,SDF-1表達上調(diào)觸發(fā)了MSCs遷移,促進骨再生。這表明通過對SDF-1的修飾,可促進歸巢,提高骨量,進一步證實了SDF-1與MSCs遷移的緊密聯(lián)系。

    SDF-1的趨化作用也受趨化細胞CXCR4表達水平的影響,表達水平越高,歸巢能力越高,且SDF-1對不表達CXCR4的細胞不具有趨化歸巢的作用[12]。Sanghani等[13]用CXCR4轉(zhuǎn)染MSCs并注射到OVX大鼠中發(fā)現(xiàn),CXCR4轉(zhuǎn)染能夠顯著提高OVX-MSCs的CXCR4的表達(從19%到40%),僅能較少提高年輕大鼠MSCs的CXCR4表達(5%),未轉(zhuǎn)染的年輕MSCs能夠高表達內(nèi)源性CXCR4(92%)。年輕MSCs能夠具有高表達CXCR4的能力,因而,Sui等[14]認為,移植年輕或健康MSCs治療OP時,無需用CXCR4進行轉(zhuǎn)染。

    2.2 干細胞歸巢與細胞間接觸

    通過SDF-1/CXCR4軸啟動MSCs歸巢后,為了使細胞遷移,必須破壞細胞與細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的接觸,為此,需通過局部釋放酶來破壞鈣粘蛋白和整合素的接觸。整合素α4β1結(jié)合纖維粘連蛋白和血管細胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)可促進干細胞的遷移,且用其擬肽制配體與對骨有高度親和力的藥物結(jié)合可改善骨髓間充質(zhì)干細胞的歸巢,增加骨膜部位的骨形成[1]。破壞細胞原有接觸的過程也與AKT的活化有關(guān),AKT可能通過增加肌動蛋白和肌球蛋白的分泌促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSC)的遷移,也可能與降解細胞外基質(zhì)及基底膜有關(guān)。Liu等[9]用ADM3100(SDF-1阻斷劑)預處理細胞對SDF-1表達進行觀察后發(fā)現(xiàn),細胞磷酸化AKT(p-AKT)的水平降低。這些結(jié)果表明干細胞在相應的條件下可以破壞細胞間、細胞與基質(zhì)間原有的接觸,促使遷移的發(fā)生。

    2.3 干細胞歸巢與成骨分化

    干細胞遷移后發(fā)生成骨分化時,成骨相關(guān)因素也對MSCs的遷移產(chǎn)生影響。汪偉等[15]的研究表明,Runx2基因過表達可能激活了CXCL12(即SDF-1)/CXCR4信號軸,從而促進了MSCs的體外遷移。但是當MSCs分化為成骨細胞后,SDF-1/CXCR4信號軸對已分化為成骨細胞的MSCs將不再具有趨向性。Sanghani-Kerai等[10]的研究也表明,轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs分化為成骨細胞后,盡管其能夠表達CXCR4,但并不向SDF-1遷移,這可能與分化后細胞外基質(zhì)的沉積及基質(zhì)金屬蛋白酶使SDF-1失活有關(guān)??梢?,SDF-1/CXCR4是啟動干細胞歸巢的關(guān)鍵軸之一。歸巢啟動后,整合素與鈣粘蛋白的結(jié)合降低破壞了細胞與細胞、細胞與基質(zhì)的接觸,促進了干細胞的歸巢。然而,遷移后的干細胞成骨分化后,其遷移能力將會降低。這種現(xiàn)象可能與細胞外基質(zhì)的沉積及基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌使SDF-1失活有關(guān)。相關(guān)激素的運用也能夠促進干細胞的遷移,但該方面的研究較少,其機制尚不明確。

    3 補腎法促干細胞歸巢

    先天之精具有干細胞的屬性。干細胞是腎精在分子水平的表現(xiàn)形式[16]。先天之精不足導致干細胞的“陽化氣”功能受損,使干細胞歸巢能力減弱,進而影響“陰成形”功能。補腎法可補充腎精并激發(fā)機體“陽化氣”功能促進干細胞歸巢,進而促進干細胞“陰成形”的成骨功能,恢復丟失骨量,從而治療OP。當人體處于疾病狀態(tài),干細胞的“陽化氣”功能降低,自身的干細胞無法滿足促進損傷組織修復的需求,需要進行外源性干細胞注射,但其歸巢效率低[17],需要通過補腎法激發(fā)干細胞“陽化氣”功能改善歸巢效率。補腎法可通過激發(fā)內(nèi)外源性干細胞的“陽化氣”功能促進干細胞的歸巢。

    3.1 補腎法促內(nèi)源性干細胞歸巢

    3.1.1補腎中藥促內(nèi)源性干細胞歸巢:大量研究證實補腎中藥在促進內(nèi)源性干細胞歸巢中發(fā)揮著重要作用,且主要與生長因子及干細胞表面受體的表達相關(guān)。具有補腎功效的中藥牛膝提取物杯莧甾酮能夠上調(diào)干細胞CXCR4的表達,進而激發(fā)大鼠BMSCs體外遷移[18]。補腎中藥淫羊藿提取物淫羊藿苷也具有促進MSC遷移的能力,進一步實驗運用CXCR4的拮抗劑AMD3100處理后,這種遷移能力被阻斷[19]。此外,補腎中藥熟地提取物[20]、骨碎補總黃酮[21]、骨碎補柚皮苷[22]均能夠上調(diào)SDF-1/CXCR4的表達,進而促進干細胞的遷移。趙志虎等[22]的研究進一步表明,骨碎補柚皮苷促進MSC遷移的能力可能通過SDF-1α/CXCR4/PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)。以上結(jié)果證實了補腎中藥可促進內(nèi)源性干細胞的遷移,而這種能力與SDF-1/CXCR4軸密切相關(guān)。

    3.1.2補腎方劑促內(nèi)源性干細胞歸巢:內(nèi)源性干細胞歸巢能力減弱是引起OP的重要因素。補腎方劑在促進內(nèi)源性干細胞歸巢、抗骨質(zhì)疏松中發(fā)揮著重要作用。王華偉等[23]的研究表明,補腎化瘀生新方可能通過促進BMSCs歸巢參與了組織的修復。此外,補腎益精方[24]、補腎活血湯含藥血清[25-26]均被證實能夠啟動SDF-1/CXCR-4信號軸促進BMCs的遷移。

    研究發(fā)現(xiàn),補腎活血湯促進BMSCs的能力與單核細胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和趨化因子受體-2(CC chemokine receptor 2,CCR2)相關(guān)[27]。吳志方等[28-29]的研究表明,補腎活血湯4種有效提取物(石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物)均能促進大鼠BMSCs體外遷移,這種促進遷移的能力可能與MCP-1/CCR2上調(diào)Wnt5a的表達有關(guān)。黃永銓等[30]的研究也表明,補腎活血湯的促MSCs體外遷移能力可能與MSCs表面的受體CCR2相關(guān)。此外,蔡炎等[30]的研究則表明,這4種提取物在具備各自最佳濃度時均可成為活性部位,且可能通過BMSCs表面相關(guān)受體人胰島素樣生長因子2受體提升遷移能力。石油醚部位提取物還可能通過下調(diào)miR-539及靶向Wnt5a信號通路促進MSCs遷移[31]。錢偉宏等[32]的研究表明,補腎活血湯還可能通過CXCL13/CXCR5信號軸及SDF-1/CXCR4信號軸參與了BMSCs遷移的促進。

    溫陽補腎方在促干細胞歸巢、抗OP中也發(fā)揮著重要作用。血小板衍生生長因子(platele derived growth factor,PDGF)已被證實可促進內(nèi)源性MSC遷移[33]。相關(guān)實驗已經(jīng)證明,將VCAM-1抗體與小鼠MSC表面結(jié)合能促進MSC向骨髓的歸巢。吳多藝等[34]、羅賢紅等[35]分別對146例、60例骨質(zhì)疏松骨折恢復期患者隨機分組,運用中醫(yī)溫陽補腎方治療3個月、1個月后均發(fā)現(xiàn),患者的血清骨鈣素、PDGF與類胰島素一號生長因子顯著升高,血清VCAM-1降低,骨密度增加,提示溫陽補腎方可促內(nèi)源性干細胞歸巢,從而促成骨,提高骨密度,且與PDGF、VCAM-1密切相關(guān)。

    此外,“補腎活血舒筋方”也具有促進BMSCs遷移的能力,且可能與NF-κB、CXCR4有關(guān)[36]。補髓生血顆粒也能夠促進細胞的遷移,這可能與調(diào)控Src/PLC/IP3通路及調(diào)控異常Ca2+[37]或調(diào)控FAK/PI3K通路及Rho GTP酶有關(guān)[38];也可能與調(diào)節(jié)VLA-4和VLA-5 mRNA相關(guān)[39]。

    以上大量的研究證實了補腎中藥及補腎方劑能夠通過調(diào)節(jié)干細胞歸巢的各個階段促進內(nèi)源性干細胞的歸巢。

    3.2 補腎法促外源性干細胞歸巢

    OP患者處于疾病狀態(tài),內(nèi)源性干細胞功能不足或缺乏,因此,外源性移植是較好的治療策略[17]。補腎法在促外源性干細胞歸巢中發(fā)揮著重要作用,徐志明等[40]等運用補腎活血湯聯(lián)合靜脈注射PKH26標記的BMSCs發(fā)現(xiàn),補腎活血湯促進移植后的外源性BMSCs向大鼠骨折斷端遷移。筆者的前期研究[41]運用補腎中藥龜板灌胃聯(lián)合靜脈注射BrdU標記的BMSCs發(fā)現(xiàn),龜板顯著促進了外源性BMSCs歸巢,減少了椎體骨量的丟失,對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松起到了有效預防作用。以上研究提示補腎法能夠有效促進外源性干細胞的歸巢。

    綜上,補腎法能夠促進內(nèi)源性干細胞及外源性干細胞的歸巢,更好發(fā)揮出干細胞的治療作用。

    3.3 補腎法促干細胞歸巢抗OP的機理

    《類經(jīng)》云:“陽動而散,故化氣,陰靜而凝,故成形?!备杉毎臍w巢與“陽化氣”有著密切的聯(lián)系,補腎法促干細胞歸巢治療OP的關(guān)鍵在于“補腎陽”,增強“陽化氣”的功能,使得“陽生陰長”,增加骨量抗OP。

    “補腎”在促干細胞遷移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。李杰斌等[42]研究證實,補腎益精方左歸丸能夠調(diào)控衰老大鼠BMSCs歸巢,且檢測到干細胞生長因子分泌的增加。補腎法能夠通過調(diào)控SDF-1/CXCR4軸改善骨的損傷,Lien等[43]將表達CXCR4的MSCs分別經(jīng)髓內(nèi)和尾靜脈注射入免疫活性C3H/HeN小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn),其歸巢率和骨量保留率較高,提示補腎法可促進MSCs歸巢抗免疫保留骨量。此外,小劑量BMP-2和SDF-1α聯(lián)合應用可增加損傷部位原代MSCs募集來促進骨愈合[44]。而將CXCR4和一種成骨分化調(diào)節(jié)的主轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子——核結(jié)合因子α1共轉(zhuǎn)染在BMSCs上,也增強了BMSCs對OP的治療作用[43]。SDF-1/CXCR4在啟動成骨過程中起著重要作用[45],而成骨分化途徑啟動后,SDF-1/CXCR4軸將不再需要[10]。這些結(jié)果表明,補腎法通過SDF-1/CXCR4軸促進了MSCs的歸巢,且參與了成骨。但歸巢的MSCs在分化過程中并不同步[46],可能是因為在治療的不同階段遷移到缺陷部位,從而處于不同的分化階段。汪偉等[15]的研究進一步表明CXCL12基因轉(zhuǎn)染可在早期促進MSCs向成骨細胞分化,而在MSCs向成骨細胞分化的中后期無明顯影響。李汪洋等[47]的研究則表明補腎活血湯在骨折不同時期發(fā)揮的促遷移作用趨勢并不一致,早期和晚期分別以低濃度、高濃度作用明顯促進,而中期則是抑制,這種趨勢不一致與CCL12/CXCR4的表達有著密切關(guān)系。這些結(jié)果表明促進遷移后,干細胞將進行成骨的相關(guān)表達,在短期降低遷移,而后增加補腎力度可再次促進干細胞的歸巢。

    Sui等[14]將綠色熒光蛋白(GFP)標記的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCGFP)注射到小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)BMSCGFP輸注以部分凋亡為代價阻止了內(nèi)源骨髓細胞凋亡,且BMSCGFP的凋亡率小于30%,其余大部分BMSCGFP仍能繼續(xù)發(fā)揮作用,且在4周后歸巢定居后的大約40%的BMSCGFP接受成骨分化為Osx+成骨細胞祖細胞,提示補腎法可能促MSCs歸巢抗凋亡促進成骨的作用。

    以上的補腎中藥及方劑均能在一定程度具有溫補腎陽的作用。綜上,SDF-1/CXCR4信號軸促進干細胞遷移能力與補腎法中的“陽化氣”功能具有較多相似的內(nèi)涵,是補腎法“陽化氣”功能在分子水平的表現(xiàn)形式。因此,本研究認為補腎法能夠通過激發(fā)干細胞“陽化氣”的功能激活SDF-1/CXCR4信號軸促進MSCs的歸巢,并可能通過參與抗免疫、抗凋亡或直接成骨分化防治OP。

    4 小結(jié)及展望

    干細胞治療是當下研究的熱點,干細胞具有“腎精”屬性。補腎法能夠激發(fā)干細胞“陽化氣”的功能激活SDF-1/CXCR4軸,促進干細胞歸巢防治OP。歸巢后的干細胞可通過調(diào)節(jié)骨免疫、抗凋亡等途徑為具有“陰成形”特征的骨形成創(chuàng)造有利環(huán)境或成骨分化直接參與成骨抗OP。以往的研究表明了補腎法在促干細胞歸巢中的重要作用,但依舊有許多問題有待解決。如:(1)MSCs的骨歸巢仍未有公認遷移分子且歸巢機制不明;(2)MSCs移植后的“肺首過效應”“血液清除”效應難以避免,降低了歸巢效率;(3)補腎中藥成分眾多,有效成分提取及鑒定存在困難;(4)MSC歸巢過程及歸巢后行為機制尚不完全明確;(5)MSCs遷移能力與成骨分化的相互作用機制研究較少;(6)內(nèi)分泌、旁分泌效應如何影響干細胞歸巢研究較少。

    針對這些問題,通過補腎法促進MSCs歸巢促進骨再生研究的前景包括:(1)構(gòu)建熒光標記MSC,利用成像系統(tǒng)實時觀察MSC在體內(nèi)的遷移,為MSC在體內(nèi)的遷移提供直接證據(jù)并尋找遷移因子;(2)探索“肺首過效應”及“血液清除”的機制,為提高干細胞歸巢效率提供參考;(3)進一步開展中藥有效物質(zhì)提取及鑒定的研究;(4)結(jié)合當下MSCs內(nèi)分泌、旁分泌研究熱點進一步探討MSCs的歸巢及歸巢后成骨分化機制;(5)進一步發(fā)掘和完善干細胞歸巢的中醫(yī)理論基礎(chǔ)。

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