AMPK在組織工程骨促骨再生研究中的應(yīng)用及進(jìn)展

張玉敏 葛林虎 曾素娟

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科， 廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，廣東 廣州 510182

骨質(zhì)疏松、腫瘤、外傷及骨髓炎等均可造成患者骨缺損、骨骼畸形及功能障礙，進(jìn)而影響生活質(zhì)量。鑒于傳統(tǒng)骨移植修復(fù)方式帶來的免疫排斥及供體不足等諸多缺點，組織工程骨(tissue engineered bone，TEB)促骨再生聯(lián)合MSCs誘導(dǎo)成骨可克服上述缺點，在骨缺損修復(fù)和再生領(lǐng)域具有廣闊前景。AMPK是一種細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)介質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝及機(jī)體能量儲存與消耗。體內(nèi)外研究顯示AMPK的活化可顯著促進(jìn)新骨形成，過表達(dá)AMPKα1及α2均使小鼠體內(nèi)異位骨形成增加[1]，這表明AMPK還參與了骨組織生理活動的調(diào)控。本文將綜述AMPK在TEB促骨再生中的最新研究進(jìn)展，以期為骨缺損修復(fù)及骨再生提供新思路。

1 AMPK結(jié)構(gòu)和激活

AMPK是由催化性α亞基及調(diào)節(jié)性β和γ亞基構(gòu)成的異源三聚體。大多數(shù)真核生物的基因組中都編碼其中一種亞型的基因，而哺乳動物可編碼多種亞型(α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3)的基因。組織間AMPK亞型的表達(dá)水平不同，衍生出多種亞型組合。近期研究顯示小分子配體對AMPK亞型激活可能因其亞型組成的不同而存在顯著差異，這為研發(fā)AMPK同工型選擇性激活劑提供新思路[2]。

哺乳動物體內(nèi)激活A(yù)MPK常通過3種機(jī)制結(jié)合5'-AMP來實現(xiàn)：①上游激酶促進(jìn)α亞基中Thr172磷酸化；②蛋白磷酸酶抑制Thr172去磷酸化；③變構(gòu)激活。腺苷酸激酶反應(yīng)(2ADP→ATP+AMP)在大部分細(xì)胞中接近平衡，而AMP對Thr172去磷酸化作用比ADP更強(qiáng)，因此，AMPK的活性主要受細(xì)胞中AMP/ATP比率的調(diào)節(jié)，AMP/ATP 比率升高，則AMPK被激活[3]。除了AMP水平的調(diào)控外，其他非典型途徑也可調(diào)控AMPK。肝激酶B1(LKB1)、鈣/鈣調(diào)素依耐性蛋白激酶(CaMKK)和轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(TAK1)等上游激酶可完全激活A(yù)MPK。另外，介導(dǎo)AMPK泛素化降解的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡DNA片段化因子45樣效應(yīng)因子a(CIDEa)及Ras激酶抑制劑2(KSR2)也可調(diào)控AMPK[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸、白藜蘆醇和小檗堿等天然營養(yǎng)物質(zhì)對AMPK具有正調(diào)控作用，可能成為活化AMPK的藥物[5]。最近Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)胞外葡萄糖和胞內(nèi)果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)的降低也能激活A(yù)MPK，而急性葡萄糖饑餓通過減少FBP與醛縮酶溶酶體上的軸蛋白結(jié)合來激活A(yù)MPK/LKB1通路，從而導(dǎo)致AMPK的激活不依賴于AMP而改變。

2 AMPK在TEB促骨再生中的研究

2.1 AMPK對MSCs成骨分化的調(diào)控

骨形成的兩種成骨方式軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨均始于MSCs。研究表明AMPK可調(diào)控MSCs成骨分化，并能調(diào)節(jié)成骨和成脂分化的平衡。Chen等[7]證實AMPK激活劑二甲雙胍和A769662 通過調(diào)控Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的活性來抑制C3H10T1/2 MSCs成脂分化和促進(jìn)其成骨分化。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可激活A(yù)MPK/LKB1信號通路，從而促進(jìn)多能干細(xì)胞來源MSCs(iPSC-MSCs)形成更多的礦化結(jié)節(jié)，且可顯著上調(diào)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Runx2和Osterix(Osx)等成骨相關(guān)因子的表達(dá)。Kim等[9]使用Compound C或shRNA 沉默MSCs的AMPKα1基因后，AMPKα1蛋白水平均降低，脂肪生成增多，礦化基質(zhì)卻明顯減少，表明AMPK的沉默可負(fù)向調(diào)節(jié)MSCs成骨分化而正調(diào)節(jié)脂肪分化。上述研究表明AMPK可能是MSCs分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，激活A(yù)MPK能夠增強(qiáng)MSCs的成骨潛能，正向調(diào)節(jié)骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

2.2 AMPK對成骨細(xì)胞的作用

成骨細(xì)胞起源于MSCs，負(fù)責(zé)骨的形成和骨質(zhì)量的維持。AMPK通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化促進(jìn)骨再生，然而控制成骨細(xì)胞分化的機(jī)制尚未完全闡明。Runx2、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Osx及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等是成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子和誘導(dǎo)因子，AMPK通過增強(qiáng)它們的表達(dá)來促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化。近期研究表明，AMPK活性是BMP2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化所必需的，其參與了BMP 2誘導(dǎo)的Runx2表達(dá)，而與Osx表達(dá)無關(guān)，抑制AMPK后可顯著降低BMP2的骨誘導(dǎo)作用，并證明AMPK不參與BMP-2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Smad磷酸化，這表明AMPK可能在Smad下游或非Smad通路中對成骨細(xì)胞分化發(fā)揮作用[10]。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞分化通過激活A(yù)MPK引起B(yǎng)MP2及其下游Smad1磷酸化，而此發(fā)現(xiàn)和部分研究結(jié)果[10]并不一致。顯然AMPK/BMP2對成骨細(xì)胞的確切作用尚有待探索。Chava1等[12]發(fā)現(xiàn)Runx2是AMPK的新型調(diào)節(jié)底物，活化的AMPK和RUNX2-S118磷酸化與成骨作用密切相關(guān)，并證明AMPK可能維持骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，低水平AMPK有利于脂肪生成，而高水平AMPK通過穩(wěn)定Runx2蛋白而促使骨細(xì)胞的形成。另外，活化的AMPK通過增強(qiáng)Runx2和小異源二聚體伴侶的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化，同時通過增加成骨細(xì)胞的骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和降低NF-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá)，從而發(fā)揮潛在的抗破骨作用[13]。

2.3 AMPK對破骨細(xì)胞的作用

破骨細(xì)胞是多核、終末分化的骨吸收細(xì)胞，骨組織通過破骨細(xì)胞吸收舊骨和成骨細(xì)胞形成新骨來不斷更新和重建。OPG/NF-κB 受體活化因子(RANK)/RANKL系統(tǒng)是調(diào)控破骨細(xì)胞形成的主要信號軸。破骨細(xì)胞存活受細(xì)胞內(nèi)外ATP相互變化的調(diào)節(jié)，AMPK作為細(xì)胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)可調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和功能[14]。先前研究表明AMPK的活化顯著降低RANKL的表達(dá)，可作為RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，提示激活A(yù)MPK直接抑制破骨細(xì)胞的生成，并通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中的OPG/RANKL信號間接抑制破骨細(xì)胞的分化[15]。另有研究表明AMPK對破骨細(xì)胞的抑制作用與其抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收相關(guān)的因子有關(guān)，包括活化T細(xì)胞核因子c1(NFATc1)、c-Fos、脾酪氨酸激酶(Syk)、組織蛋白酶K(CTSK)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)[14]。最近，Tong等[16]發(fā)現(xiàn)抑制AMPK后使雷帕霉素(mTOR)和下游靶標(biāo)p70S6K磷酸化增加，減少細(xì)胞自噬，逆轉(zhuǎn)OPG對破骨細(xì)胞分化的抑制作用。由此可見，AMPK在破骨細(xì)胞分化和骨吸收中的作用仍存在爭議。

2.4 AMPK對血管再生的作用

骨的形成和再生過程關(guān)鍵取決于生長板區(qū)域血管的形成，這是由成骨細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用引起的，然而確切的機(jī)制仍有待闡明。體內(nèi)外研究表明人臍帶MSCs來源的外泌體通過增加VEGF和低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)血管新生，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合[17]。AMPK不僅對內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，還能刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化，發(fā)揮更好的促血管效應(yīng)。研究表明二甲雙胍可改善小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成血管能力和遷移能力，加速糖尿病小鼠骨創(chuàng)面愈合及血管生成，并且通過激活A(yù)MPK增加一氧化氮的釋放來改善內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管生成功能，從而保護(hù)血管免受損傷[18]。Qu等[19]發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPK通路后可上調(diào)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、Runx2、OCN和VEGF的mRNA水平，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化及血管生成。綜上可知，AMPK可通過調(diào)節(jié)血管生成促進(jìn)骨再生。

3 AMPK在TEB促骨再生中的作用機(jī)制

3.1 AMPK通過抑制活性氧產(chǎn)生來促進(jìn)骨再生

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物反應(yīng)產(chǎn)生能量的副產(chǎn)物，主要通過氧化代謝途徑產(chǎn)生于線粒體內(nèi)。低水平ROS參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、特異性分化和自我更新等生物功能。激活A(yù)MPK通過抑制ROS的產(chǎn)生，恢復(fù)糖尿病小鼠成骨細(xì)胞的功能及促進(jìn)骨再生[20]。AMPKα1的上調(diào)抑制了ROS的產(chǎn)生，增強(qiáng)人脂肪組織來源的MSCs成骨分化[21]。最近Zhou等[22]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過激活A(yù)MPK通路下調(diào)內(nèi)源性ROS生成，進(jìn)而促進(jìn)衰老BMSCs的成骨分化。

ROS增多引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)會影響成骨細(xì)胞的存活、增殖及分化，且與骨質(zhì)疏松癥等許多代謝性疾病的發(fā)生有關(guān)。AMPK在不同細(xì)胞類型中應(yīng)對氧化應(yīng)激時起保護(hù)作用[23]。Fan等[24]發(fā)現(xiàn)AMPK活化后可激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)信號，從而抑制地塞米松誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激保護(hù)成骨細(xì)胞免受損傷。近期研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激通過抑制AMPK通路來抑制BMSCs成骨分化，反之，運用褪黑素激活A(yù)MPK/FOXO3a/RUNX2通路后使BMSCs恢復(fù)體外成骨分化潛能[25]。綜上所述，激活A(yù)MPK可抑制ROS產(chǎn)生及保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，從而促進(jìn)骨再生。

3.2 AMPK通過促使細(xì)胞自噬來促進(jìn)骨再生

自噬是MSCs分化過程中細(xì)胞體積降解的主要途徑，與成骨和骨骼發(fā)育有關(guān)，細(xì)胞自噬減少可導(dǎo)致小鼠骨量下降[26]。AMPK和mTOR靶標(biāo)對自噬至關(guān)重要，AMPK通過抑制mTOR活性來激活自噬。Vidoni等[27]研究表明白藜蘆醇和成骨誘導(dǎo)因子地塞米松、β-甘油磷酸酯和抗壞血酸協(xié)同激活A(yù)MPK/BECLIN-1通路調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，促進(jìn)人牙齦MSCs的成骨分化。Bai等[28]發(fā)現(xiàn)活化的AMPK可抑制p-mTOR活性，激活BMSCs自噬來促進(jìn)肥大細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨修復(fù)。下調(diào)AMPKα表達(dá)抑制自噬，直接減少破骨細(xì)胞生存和增殖[29]。體外研究報道通過AMPK/mTOR通路介導(dǎo)BMSCs成骨分化和自噬過程之間的串?dāng)_[30]。最近Cheng等[31]發(fā)現(xiàn)鍶處理MC3T3E1細(xì)胞后p-AMPK表達(dá)增加，啟動細(xì)胞自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)下游分子p-mTOR表達(dá)降低，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，結(jié)果證實AMPK/mTOR信號通路在自噬促進(jìn)的成骨細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。由此可見，AMPK可有效調(diào)節(jié)自噬來促進(jìn)骨平衡及再生。

3.3 AMPK通過激活SIRT1來促進(jìn)骨再生

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator type 1，SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性去乙酰化酶，可調(diào)節(jié)MSCs的新陳代謝、生長、分化和抗氧化反應(yīng)。近年來，體外研究表明直接激活SIRT1可促進(jìn)MSCs成骨分化，抑制其成脂分化。此外，SIRT1介導(dǎo)的抗氧化作用也有利于MSCs成骨分化[32]。Li等[33]報道SIRT1與細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶之間呈正相關(guān)，SIRT1促進(jìn)MSCs成骨分化后抗氧化應(yīng)激的能力顯著增強(qiáng)。

AMPK作為SIRT1主要的上游激酶，早期關(guān)于AMPK/SIRT1信號通路的研究主要與2型糖尿病、肥胖等代謝性疾病相關(guān)，近年來其在骨形成中的作用也逐漸引起重視。Wang等[34]發(fā)現(xiàn)小分子化合物KGN通過激活A(yù)MPK/SIRT1通路改善細(xì)胞內(nèi)抗氧化性能，促進(jìn)BMSCs成骨分化。另有研究證實機(jī)械拉伸誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)，并通過激活A(yù)MPK/SIRT1通路促進(jìn)BMSCs的成骨分化，相反，運用Compound C及乙酰化酶分別抑制AMPK及SIRT1的表達(dá)后，細(xì)胞抗氧化活性下降，鈣化物沉積及成骨基因BGLAP及Runx2水平顯著下降，促成骨作用被逆轉(zhuǎn)[35]。因此，AMPK/SIRT1信號通路可能是調(diào)控MSCs成骨分化機(jī)制之一。

綜上所述，骨再生是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及血管等多種因素相互作用下的結(jié)果。AMPK在TEB促骨再生中具有重要的調(diào)節(jié)作用，近年來研究顯示AMPK參與骨再生作用機(jī)制可能與ROS、細(xì)胞自噬及SIRT1等有關(guān)，但其確切機(jī)制尚不明確。由于目前研究中使用的AMPK激活藥物缺乏特異性，且AMPK在不同組織中亞型組合也不同，骨組織中特異性AMPK激活劑尚未發(fā)現(xiàn)，使其很難應(yīng)用于體內(nèi)試驗進(jìn)而影響研究結(jié)果的可靠性。因此，關(guān)于AMPK在骨組織中累積整體水平及作用機(jī)制仍需深入探究，使其進(jìn)一步指導(dǎo)臨床骨缺損治療及用藥。