AMPK在組織工程骨促骨再生研究中的應用及進展

張玉敏 葛林虎 曾素娟

廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科， 廣州市口腔再生醫(yī)學基礎(chǔ)與應用研究重點實驗室，廣東 廣州 510182

骨質(zhì)疏松、腫瘤、外傷及骨髓炎等均可造成患者骨缺損、骨骼畸形及功能障礙，進而影響生活質(zhì)量。鑒于傳統(tǒng)骨移植修復方式帶來的免疫排斥及供體不足等諸多缺點，組織工程骨(tissue engineered bone，TEB)促骨再生聯(lián)合MSCs誘導成骨可克服上述缺點，在骨缺損修復和再生領(lǐng)域具有廣闊前景。AMPK是一種細胞能量穩(wěn)態(tài)介質(zhì)，調(diào)節(jié)細胞能量代謝及機體能量儲存與消耗。體內(nèi)外研究顯示AMPK的活化可顯著促進新骨形成，過表達AMPKα1及α2均使小鼠體內(nèi)異位骨形成增加[1]，這表明AMPK還參與了骨組織生理活動的調(diào)控。本文將綜述AMPK在TEB促骨再生中的最新研究進展，以期為骨缺損修復及骨再生提供新思路。

1 AMPK結(jié)構(gòu)和激活

AMPK是由催化性α亞基及調(diào)節(jié)性β和γ亞基構(gòu)成的異源三聚體。大多數(shù)真核生物的基因組中都編碼其中一種亞型的基因，而哺乳動物可編碼多種亞型(α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3)的基因。組織間AMPK亞型的表達水平不同，衍生出多種亞型組合。近期研究顯示小分子配體對AMPK亞型激活可能因其亞型組成的不同而存在顯著差異，這為研發(fā)AMPK同工型選擇性激活劑提供新思路[2]。

哺乳動物體內(nèi)激活AMPK常通過3種機制結(jié)合5'-AMP來實現(xiàn)：①上游激酶促進α亞基中Thr172磷酸化；②蛋白磷酸酶抑制Thr172去磷酸化；③變構(gòu)激活。腺苷酸激酶反應(2ADP→ATP+AMP)在大部分細胞中接近平衡，而AMP對Thr172去磷酸化作用比ADP更強，因此，AMPK的活性主要受細胞中AMP/ATP比率的調(diào)節(jié)，AMP/ATP 比率升高，則AMPK被激活[3]。除了AMP水平的調(diào)控外，其他非典型途徑也可調(diào)控AMPK。肝激酶B1(LKB1)、鈣/鈣調(diào)素依耐性蛋白激酶(CaMKK)和轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(TAK1)等上游激酶可完全激活AMPK。另外，介導AMPK泛素化降解的誘導細胞凋亡DNA片段化因子45樣效應因子a(CIDEa)及Ras激酶抑制劑2(KSR2)也可調(diào)控AMPK[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸、白藜蘆醇和小檗堿等天然營養(yǎng)物質(zhì)對AMPK具有正調(diào)控作用，可能成為活化AMPK的藥物[5]。最近Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)胞外葡萄糖和胞內(nèi)果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)的降低也能激活AMPK，而急性葡萄糖饑餓通過減少FBP與醛縮酶溶酶體上的軸蛋白結(jié)合來激活AMPK/LKB1通路，從而導致AMPK的激活不依賴于AMP而改變。

2 AMPK在TEB促骨再生中的研究

2.1 AMPK對MSCs成骨分化的調(diào)控

骨形成的兩種成骨方式軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨均始于MSCs。研究表明AMPK可調(diào)控MSCs成骨分化，并能調(diào)節(jié)成骨和成脂分化的平衡。Chen等[7]證實AMPK激活劑二甲雙胍和A769662 通過調(diào)控Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的活性來抑制C3H10T1/2 MSCs成脂分化和促進其成骨分化。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可激活AMPK/LKB1信號通路，從而促進多能干細胞來源MSCs(iPSC-MSCs)形成更多的礦化結(jié)節(jié)，且可顯著上調(diào)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Runx2和Osterix(Osx)等成骨相關(guān)因子的表達。Kim等[9]使用Compound C或shRNA 沉默MSCs的AMPKα1基因后，AMPKα1蛋白水平均降低，脂肪生成增多，礦化基質(zhì)卻明顯減少，表明AMPK的沉默可負向調(diào)節(jié)MSCs成骨分化而正調(diào)節(jié)脂肪分化。上述研究表明AMPK可能是MSCs分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，激活AMPK能夠增強MSCs的成骨潛能，正向調(diào)節(jié)骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

2.2 AMPK對成骨細胞的作用

成骨細胞起源于MSCs，負責骨的形成和骨質(zhì)量的維持。AMPK通過調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖、分化和礦化促進骨再生，然而控制成骨細胞分化的機制尚未完全闡明。Runx2、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Osx及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等是成骨細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子和誘導因子，AMPK通過增強它們的表達來促進成骨細胞分化和礦化。近期研究表明，AMPK活性是BMP2誘導成骨細胞礦化所必需的，其參與了BMP 2誘導的Runx2表達，而與Osx表達無關(guān)，抑制AMPK后可顯著降低BMP2的骨誘導作用，并證明AMPK不參與BMP-2誘導的細胞內(nèi)Smad磷酸化，這表明AMPK可能在Smad下游或非Smad通路中對成骨細胞分化發(fā)揮作用[10]。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)成骨細胞分化通過激活AMPK引起B(yǎng)MP2及其下游Smad1磷酸化，而此發(fā)現(xiàn)和部分研究結(jié)果[10]并不一致。顯然AMPK/BMP2對成骨細胞的確切作用尚有待探索。Chava1等[12]發(fā)現(xiàn)Runx2是AMPK的新型調(diào)節(jié)底物，活化的AMPK和RUNX2-S118磷酸化與成骨作用密切相關(guān)，并證明AMPK可能維持骨細胞與脂肪細胞的穩(wěn)態(tài)，低水平AMPK有利于脂肪生成，而高水平AMPK通過穩(wěn)定Runx2蛋白而促使骨細胞的形成。另外，活化的AMPK通過增強Runx2和小異源二聚體伴侶的表達促進成骨細胞分化和礦化，同時通過增加成骨細胞的骨保護素(osteoprotegerin，OPG)和降低NF-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達，從而發(fā)揮潛在的抗破骨作用[13]。

2.3 AMPK對破骨細胞的作用

破骨細胞是多核、終末分化的骨吸收細胞，骨組織通過破骨細胞吸收舊骨和成骨細胞形成新骨來不斷更新和重建。OPG/NF-κB 受體活化因子(RANK)/RANKL系統(tǒng)是調(diào)控破骨細胞形成的主要信號軸。破骨細胞存活受細胞內(nèi)外ATP相互變化的調(diào)節(jié)，AMPK作為細胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)可調(diào)控破骨細胞的分化和功能[14]。先前研究表明AMPK的活化顯著降低RANKL的表達，可作為RANKL誘導破骨細胞生成的負反饋調(diào)節(jié)因子，提示激活AMPK直接抑制破骨細胞的生成，并通過調(diào)節(jié)成骨細胞中的OPG/RANKL信號間接抑制破骨細胞的分化[15]。另有研究表明AMPK對破骨細胞的抑制作用與其抑制破骨細胞分化和骨吸收相關(guān)的因子有關(guān)，包括活化T細胞核因子c1(NFATc1)、c-Fos、脾酪氨酸激酶(Syk)、組織蛋白酶K(CTSK)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)[14]。最近，Tong等[16]發(fā)現(xiàn)抑制AMPK后使雷帕霉素(mTOR)和下游靶標p70S6K磷酸化增加，減少細胞自噬，逆轉(zhuǎn)OPG對破骨細胞分化的抑制作用。由此可見，AMPK在破骨細胞分化和骨吸收中的作用仍存在爭議。

2.4 AMPK對血管再生的作用

骨的形成和再生過程關(guān)鍵取決于生長板區(qū)域血管的形成，這是由成骨細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與內(nèi)皮細胞間相互作用引起的，然而確切的機制仍有待闡明。體內(nèi)外研究表明人臍帶MSCs來源的外泌體通過增加VEGF和低氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達，刺激內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促進血管新生，進而促進骨折愈合[17]。AMPK不僅對內(nèi)皮細胞具有保護作用，還能刺激內(nèi)皮祖細胞的分化，發(fā)揮更好的促血管效應。研究表明二甲雙胍可改善小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成血管能力和遷移能力，加速糖尿病小鼠骨創(chuàng)面愈合及血管生成，并且通過激活AMPK增加一氧化氮的釋放來改善內(nèi)皮祖細胞的血管生成功能，從而保護血管免受損傷[18]。Qu等[19]發(fā)現(xiàn)激活AMPK通路后可上調(diào)小鼠MC3T3-E1細胞中ALP、Runx2、OCN和VEGF的mRNA水平，進而促進成骨分化及血管生成。綜上可知，AMPK可通過調(diào)節(jié)血管生成促進骨再生。

3 AMPK在TEB促骨再生中的作用機制

3.1 AMPK通過抑制活性氧產(chǎn)生來促進骨再生

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物反應產(chǎn)生能量的副產(chǎn)物，主要通過氧化代謝途徑產(chǎn)生于線粒體內(nèi)。低水平ROS參與細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細胞增殖、特異性分化和自我更新等生物功能。激活AMPK通過抑制ROS的產(chǎn)生，恢復糖尿病小鼠成骨細胞的功能及促進骨再生[20]。AMPKα1的上調(diào)抑制了ROS的產(chǎn)生，增強人脂肪組織來源的MSCs成骨分化[21]。最近Zhou等[22]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過激活AMPK通路下調(diào)內(nèi)源性ROS生成，進而促進衰老BMSCs的成骨分化。

ROS增多引起的氧化應激反應會影響成骨細胞的存活、增殖及分化，且與骨質(zhì)疏松癥等許多代謝性疾病的發(fā)生有關(guān)。AMPK在不同細胞類型中應對氧化應激時起保護作用[23]。Fan等[24]發(fā)現(xiàn)AMPK活化后可激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)信號，從而抑制地塞米松誘導的氧化應激保護成骨細胞免受損傷。近期研究發(fā)現(xiàn)氧化應激通過抑制AMPK通路來抑制BMSCs成骨分化，反之，運用褪黑素激活AMPK/FOXO3a/RUNX2通路后使BMSCs恢復體外成骨分化潛能[25]。綜上所述，激活AMPK可抑制ROS產(chǎn)生及保護細胞免受氧化應激損傷，從而促進骨再生。

3.2 AMPK通過促使細胞自噬來促進骨再生

自噬是MSCs分化過程中細胞體積降解的主要途徑，與成骨和骨骼發(fā)育有關(guān)，細胞自噬減少可導致小鼠骨量下降[26]。AMPK和mTOR靶標對自噬至關(guān)重要，AMPK通過抑制mTOR活性來激活自噬。Vidoni等[27]研究表明白藜蘆醇和成骨誘導因子地塞米松、β-甘油磷酸酯和抗壞血酸協(xié)同激活AMPK/BECLIN-1通路調(diào)節(jié)細胞自噬，促進人牙齦MSCs的成骨分化。Bai等[28]發(fā)現(xiàn)活化的AMPK可抑制p-mTOR活性，激活BMSCs自噬來促進肥大細胞及軟骨細胞的分化，進而促進軟骨內(nèi)成骨修復。下調(diào)AMPKα表達抑制自噬，直接減少破骨細胞生存和增殖[29]。體外研究報道通過AMPK/mTOR通路介導BMSCs成骨分化和自噬過程之間的串擾[30]。最近Cheng等[31]發(fā)現(xiàn)鍶處理MC3T3E1細胞后p-AMPK表達增加，啟動細胞自噬，進而誘導下游分子p-mTOR表達降低，促進細胞成骨分化，結(jié)果證實AMPK/mTOR信號通路在自噬促進的成骨細胞分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。由此可見，AMPK可有效調(diào)節(jié)自噬來促進骨平衡及再生。

3.3 AMPK通過激活SIRT1來促進骨再生

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator type 1，SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性去乙?；?，可調(diào)節(jié)MSCs的新陳代謝、生長、分化和抗氧化反應。近年來，體外研究表明直接激活SIRT1可促進MSCs成骨分化，抑制其成脂分化。此外，SIRT1介導的抗氧化作用也有利于MSCs成骨分化[32]。Li等[33]報道SIRT1與細胞內(nèi)抗氧化酶之間呈正相關(guān)，SIRT1促進MSCs成骨分化后抗氧化應激的能力顯著增強。

AMPK作為SIRT1主要的上游激酶，早期關(guān)于AMPK/SIRT1信號通路的研究主要與2型糖尿病、肥胖等代謝性疾病相關(guān)，近年來其在骨形成中的作用也逐漸引起重視。Wang等[34]發(fā)現(xiàn)小分子化合物KGN通過激活AMPK/SIRT1通路改善細胞內(nèi)抗氧化性能，促進BMSCs成骨分化。另有研究證實機械拉伸誘導細胞抗氧化反應，并通過激活AMPK/SIRT1通路促進BMSCs的成骨分化，相反，運用Compound C及乙酰化酶分別抑制AMPK及SIRT1的表達后，細胞抗氧化活性下降，鈣化物沉積及成骨基因BGLAP及Runx2水平顯著下降，促成骨作用被逆轉(zhuǎn)[35]。因此，AMPK/SIRT1信號通路可能是調(diào)控MSCs成骨分化機制之一。

綜上所述，骨再生是成骨細胞、破骨細胞及血管等多種因素相互作用下的結(jié)果。AMPK在TEB促骨再生中具有重要的調(diào)節(jié)作用，近年來研究顯示AMPK參與骨再生作用機制可能與ROS、細胞自噬及SIRT1等有關(guān)，但其確切機制尚不明確。由于目前研究中使用的AMPK激活藥物缺乏特異性，且AMPK在不同組織中亞型組合也不同，骨組織中特異性AMPK激活劑尚未發(fā)現(xiàn)，使其很難應用于體內(nèi)試驗進而影響研究結(jié)果的可靠性。因此，關(guān)于AMPK在骨組織中累積整體水平及作用機制仍需深入探究，使其進一步指導臨床骨缺損治療及用藥。