陰道自取樣HPV檢測的研究進展*

羅紅學,王 悅,王建六

(北京大學人民醫(yī)院,北京 100044)

1 自取樣HPV檢測的背景和概念

高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hrHPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的必要條件。諸多研究證實,HPV病毒分子的檢測技術具有比細胞學更高的高級別宮頸病變篩查敏感性,并且能提供更好的陰性預測值保護,延長篩查間隔時間。目前,HPV檢測已從輔助細胞學開始逐漸替代后者成為宮頸癌初篩的主要手段[1]。HPV檢測的另一個重要優(yōu)點是,它對樣本質(zhì)和量要求較低,故而可采用陰道自取樣。所謂自取樣是指患者自行將取樣器插入陰道采集的宮頸/陰道脫落細胞樣本,即自取樣本,可通過郵寄或集中送檢方式到達檢測機構(gòu),省時省力、簡單方便,該取樣模式免除了由臨床醫(yī)生在醫(yī)院以婦科檢查方式收集患者宮頸脫落細胞樣本(醫(yī)取樣本)及其所必需的醫(yī)療成本,具有大幅度提高篩查覆蓋率的能力,尤其是在醫(yī)療資源匱乏和宗教文化抵觸的地區(qū)。已有大量證據(jù)表明,自取樣HPV檢測優(yōu)于細胞學,與醫(yī)生取樣HPV檢測相比,HPV的檢出率和亞型分布具有很好的一致性,在高級別宮頸病變檢測敏感性方面也相當[2]。近年來,宮頸癌自取樣篩查的研究除了在驗證適合的檢測技術方面有較大進展外,自取樣的取樣方式、取樣工具、樣本的保存形式,乃至自取樣本的來源、自取樣篩查的開展和組織形式等各個方面也有很多研究和報道,現(xiàn)就自取樣宮頸癌篩查研究進展做綜述性介紹。

2 陰道自取樣HPV檢測技術

第二代雜交捕獲技術(Hybrid Capture 2,HC2)作為最早,也是最多被用于自取樣研究的非聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)基礎的HPV檢測技術,其原理是利用對抗體雜交捕獲放大和收集化學發(fā)光信號來實現(xiàn)對HPV相對含量的測定[3],但采用不同方式采集的陰道自取樣本進行檢測,敏感性均不如細胞學。對于自然人群CIN2+的檢測,自取樣敏感性僅為醫(yī)生取樣的62%～87%[4]。另一種基于雜交捕獲原理的HPV檢測方法,CareHPV檢測技術,也被證實僅能達到80%敏感性[5]。Cervista作為繼HC2之后的第二個被批準用于輔助細胞學篩查的HPV檢測方法,檢測原理是基于HPV-DNA酶切擴增和信號放大技術[6],但應用于自取樣在檢測CIN3+時,僅有71%左右的敏感性[2]。Aptima是源于Hologic公司的一種新型HPV檢測技術,針對的是HPV致癌基因E6和E7的mRNA,雖然不是基于PCR的檢測技術,但是檢驗過程中,在目標捕獲完成后,mRNA將會通過轉(zhuǎn)錄介導核酸擴增方法(TMA)得以擴增。Dockter等[7]開展的一項多中心對照研究結(jié)果顯示,該方法和HC2相比,敏感性相當,特異性更高。但是在兩項非洲研究中,Aptima方法用于檢測自取樣本,對HSIL病變的敏感性均低于醫(yī)生取樣的80%[8]。個別非PCR基礎上的檢測方法如DNA Chip等,檢測自取樣本獲得了較醫(yī)生取樣略高的CIN3+檢測敏感性(90.5% vs 88.1%),但研究的對象不是自然人群[9]。

2010年Wu等在一項橫斷面的大人群宮頸癌篩查研究SHENCCAST-II項目中,首次將一種基于多重PCR的基因分型加質(zhì)譜平臺檢測技術MALDI-TOF-MS應用于自取樣的檢測,獲得了與醫(yī)生取樣同樣高的CIN3+檢測敏感性(94.3% vs 94.3%),由此證實以PCR為基礎的HPV檢測技術是自取樣檢測成功的關鍵[2]。隨后另外幾種基于PCR的檢測方法 HR GP5+/6+、SPF10LiPA、Abbott RT HPV PCR 等被不同實驗證實與自取樣本聯(lián)合使用也可達到與醫(yī)生取樣相當?shù)臋z測效果,但均不是在人群篩查的研究背景下完成的。

Cobas 4800 HPV即羅氏4800,是一種集自動樣品制備與實時聚合酶鏈反應(Real-Time PCR)、擴增和檢測的多重定性技術,它能單獨輸出HPV16和18兩種亞型的結(jié)果和其他12種高危型別的混合結(jié)果,是目前唯一被美國FDA、歐盟CE及中國CFDA共同認證的可用于宮頸癌初篩的HPV檢測技術。Stanczuk等[10]在2016年完成的PaVDaG研究中報道了Cobas 4800 HPV檢測陰道自取樣本與醫(yī)生取樣相比,對CIN2+/CIN3+的相對敏感性均可達97%。2014年,Yi等[11]報道了一種新型的基于新一代基因測序技術的HPV分型檢測方法(SEQ HPV),可高通量檢測14種高危型HPV并精確分型。這種HPV測序分型檢測技術與HC2檢測醫(yī)生取樣金標準的HPV檢測一致率達95%以上,CIN3+檢測敏感性約97%,與HC2檢測醫(yī)生取樣比較,差異無統(tǒng)計學意義。Du等[12]最近一項基于多中心萬例自然人群的自取樣項目(CHIMUST)研究證實,上述Cobas 4800及SEQ HPV分型技術檢測不同形式的陰道自取樣本與醫(yī)生取樣之間的HPV檢測一致性較好,CIN2+/CIN3+檢測敏感性不遜于后者。

3 陰道自取樣本采集和樣本轉(zhuǎn)運工具

陰道自取樣本較常規(guī)醫(yī)生取樣獲取的樣本細胞數(shù)相對較少,其病毒含量達不到多數(shù)基于信號放大的HPV檢測方法的最低檢測閾值。因此,采用適合的以PCR為基礎的HPV檢測技術是自取樣能成為有效篩查手段的第一步。此外,與之相匹配的自取樣方法和樣本保存形式也非常關鍵。同一種檢測技術針對不同工具采集的自取樣本,其HPV檢測一致性和CIN2+/CIN3+敏感性均存在不小差異。

拭子(Swab)是可選的自取樣采集工具之一,其形似小棉簽,頭部由砂紙、聚酯纖維或棉質(zhì)材料卷裹,臨床常用于外傷清創(chuàng)和皮膚上藥。干燥拭子一般保存在塑料小包中,濕拭子常配套裝在有轉(zhuǎn)換液的小管里。最新研究報道,用Cobas 4800和Abbott RT HPV兩種方檢測,干濕拭子之間的HPV一致性達90%[13],取樣完畢后,將拭子放入干燥塑料管,亦可置于裝有磷酸鹽緩沖液的無菌凍存管里。含自取樣本的干燥拭子可在低溫下保存3個月以上。有綜述報道,拭子自取樣本的敏感性74% ～81%,特異性88% ～90%[14]。細胞刷(Brush)是最常見的一種自取樣裝置之一,刷頭可有不同形狀,但一般由硬毛組成。目前市場上有多種產(chǎn)品,如Evalyn刷、Viba刷及錐形刷等。Evalyn刷的相關研究提示,其所取自取樣本與醫(yī)生取樣相比,HPV檢測一致性約85%[15]。自取樣刷小巧柔韌便于使用,可干燥儲存和運輸,有研究報道自取樣干刷樣本保存8天左右再行檢測,其結(jié)果與常規(guī)醫(yī)取樣仍具可比性。陰道塞(Tampon)由圓柱形的有吸收能力的材料構(gòu)成,在月經(jīng)期可塞進陰道用于吸收經(jīng)血。完整陰道塞裝置還包括一個用于推送的敷料器或塑料管,常見的如Fournier自取樣陰道塞。陰道塞可收集大量的細胞碎片,包括宮頸和陰道壁的鱗狀上皮細胞。對于CIN患者,其吸收的細胞樣本檢測結(jié)果與其放置在陰道的時間無明顯相關性。有綜述報道陰道塞的診斷敏感性67% ～94%[14]。也有學者將護墊(Pad)作為自取樣工具,通過收集檢測護墊表層的經(jīng)血濾析成分來實現(xiàn)篩查宮頸病變的目的。Kim等[16]研究結(jié)果顯示,對于CIN的檢測敏感性,護墊所采集的經(jīng)血樣本為76.9%,與常規(guī)醫(yī)生取樣相比,其一致性達97.8%。

固體洗提卡(Solid elute Card)是美國GE公司生產(chǎn)的FTA卡,臨床用于新生兒出生缺陷的篩查及病毒(如HIV)和熱帶病檢測[17],其主要部件是一張具有自動裂解細胞并吸附保存病毒DNA能力的濾紙,該濾紙片因含有變色試劑成份故可指示樣本涂抹部位。該卡片可用于儲存和轉(zhuǎn)運樣本。自取樣本可經(jīng)細胞刷或拭子獲取后涂抹在卡片上,通過打孔得到小的濾紙片,再經(jīng)簡單的加熱洗滌步驟即可獲得檢測用DNA[18]。研究表明,FTA卡保存的陰道自取樣本與自取樣的液體標本、醫(yī)生取樣之間的高危型HPV檢測一致性較好[19]。Maurer等[20]報道了一種新型的固體洗提卡“POI卡”,其構(gòu)造類似FTA卡,但該卡對CIN2+敏感性顯著高于FTA卡(74% vs 95%),其潮濕環(huán)境下穩(wěn)定性更好。固體卡輕巧方便利于自取樣本的保存和運輸,同時還有防止樣本污染的設計,配以合適的取樣細胞刷,在自取樣研究中有巨大潛力。

4 尿液樣本的HPV檢測用于宮頸癌篩查

尿液作為一種容易獲取、非侵入性的檢測樣本近來也被用于自取樣篩查研究以及疫苗接種后的隨訪研究。據(jù)報道,尿液自取樣本與宮頸細胞樣本相比,HPV檢測敏感性能達到后者的89%[21],尿液自取樣本對陰道鏡回訪者CIN2+的檢測敏感性能達92%[22]。最近一項用Cobas 4800作為檢測技術的小樣本配對實驗的結(jié)果也顯示,醫(yī)生取樣和晨起初尿自取樣本之間的HPV檢測一致性為88%,以前者為金標準HPV敏感性為90.5%,以病理結(jié)果為金標準,對CIN2/3敏感性達95%[23]。HPV病毒的核酸分子到達和存在于尿液中的機制尚不明了,各項研究的背景也不盡相同,針對尿液的HPV檢測程序和方法目前缺乏統(tǒng)一的標準。尿液檢測另一個缺點是其中的HPV病毒核酸分子并非明確來源于病變初發(fā)部位,其診斷提示意義尚有爭議。

5 自取樣HPV檢測篩查宮頸癌的模式

雖然自取樣的方式省去了陰道檢查的醫(yī)生操作步驟,患者在家中收集樣本后郵寄至檢測中心即可完成篩查,但是具體實施中還涉及婦女對篩查的認知,個人信息的登記核實,申請參與和獲得取樣器的流程,以及對自取樣操作步驟的了解。網(wǎng)絡信息技術和移動通信設備為此提供了支持,如專業(yè)的門戶網(wǎng)站、社交平臺,國外的FaceBook,國內(nèi)的微信朋友圈及公眾號等,均可以很方便地實現(xiàn)篩查相關知識的宣傳普及、登記申請、物流追蹤和檢測結(jié)果查詢。Nelson等[24]運用互聯(lián)網(wǎng)建立招募平臺完成自取樣研究顯示,研究對象對于自取樣的接受度、舒適度的評價均遠遠高于未取樣者。然而此項研究主要針對的是21～30歲年輕女性,對于信息技術的了解和運用熟練程度強于老年女性。換言之,基于互聯(lián)網(wǎng)的自取樣篩查模式能夠增加的篩查人口可能主要是來自城市年輕女性群體,這部分女性有較高的教育程度和經(jīng)濟收入,之所以未能參加篩查,除了對宮頸癌防治知識不夠了解外,主要原因可能是沒有時間、害怕麻煩或羞于婦科檢查。但自取樣篩查的模式的開展不能局限于城市家庭式的個人取樣和郵寄,因為影響整體篩查覆蓋率的還是那些經(jīng)濟狀況落后的偏遠地區(qū)和不熟悉網(wǎng)絡技術的未篩查婦女。Belinson研究團隊在人口密集的發(fā)展中國家構(gòu)建和評價了一種基于社區(qū)的自取樣篩查模式,通過聯(lián)合篩查地區(qū)的權(quán)威組織機構(gòu),培訓社區(qū)工作或村委工作的非醫(yī)務人員,并在熱衷群眾活動的積極分子幫助下,成功實現(xiàn)了農(nóng)村地區(qū)由點及面的大人群自取樣篩查運動。集中教授自取樣方法成功完成八千余例婦女的篩查,后期陽性回叫率達到了84.3%[25]。這種基于社區(qū)的自取樣篩查模式成功關鍵很大程度依賴社區(qū)人員的責任心、工作熱情和積極性,取樣過程存在很多變量。另一個重要問題是可能難以獲得篩查婦女的完整身份信息和病史記錄,可能導致重復篩查,對于檢測中心來說檢測信息的錄入也非常耗時。Wu等[26]在網(wǎng)絡自取樣篩查模式的基礎上嘗試探索了網(wǎng)絡與社區(qū)相結(jié)合的自取樣篩查模型,成功募集到預期數(shù)目的篩查人群,并實現(xiàn)了城市與農(nóng)村地區(qū)篩查婦女的線上登記。在此模型中,社區(qū)工作人員僅需要集中篩查人群,協(xié)助他們登陸篩查中心的網(wǎng)站、填寫個人信息、獲取篩查編號、發(fā)放和郵寄自取樣器材。參與篩查的婦女可從網(wǎng)站上悉知篩查相關的所有信息,包括取樣視頻指導,檢測報告解讀,以及進一步就診指引,為上述問題提供了可參考的解決方案。

6 自取樣存在的問題

除尿液自取樣和護墊/月經(jīng)血自取樣完全無創(chuàng)外,其他的陰道自取樣方式因為都需要將取樣工具插入陰道,所以都具有一定的潛在風險和危害。陰道自取樣工具使用者必須要具備基本的文化水平,能夠閱讀理解取樣指示圖譜或步驟。不按照取樣流程隨意操作或錯誤操作不僅無法取得滿意樣本,還會帶來一些醫(yī)療風險,輕者或可能穿破陰道黏膜導致出血引起心理壓力,重者可能感染(中毒)性休克。來自國內(nèi)的一項研究顯示,教育程度可能是影響婦女接受自取樣的主要原因[27]。避免生硬晦澀醫(yī)療術語,使用簡單易懂的溫馨的圖文宣傳冊、視頻指導都可實現(xiàn)這一目的。此外,還需考慮到一些肥胖的婦女、解剖學異常的婦女和陰道萎縮的老年婦女,并不能適用任意自取樣工具,需根據(jù)情況個體化選擇和研發(fā)新的采集工具。

需要指出的是,由于自取樣的“自取”性質(zhì),無論采取哪種取樣工具或樣本保存介質(zhì),自取樣標本都不可能是單一來源的陰道壁細胞或?qū)m頸脫落細胞。雖然有研究結(jié)果顯示,宮頸細胞以及陰道壁細胞的HPV檢測結(jié)果有良好的一致性,但未來當特異性分子標記物成為疾病預測一個重要指標和方向時,自取樣的標本不一定依然適用。

7 自取樣HPV檢測展望

自取樣HPV檢測雖然在檢測高級別宮頸病變的敏感性方面優(yōu)于細胞學,甚至接近醫(yī)生取樣HPV檢測的結(jié)果,但是同樣存在所有HPV檢測共同的特異性較差的問題[28]。醫(yī)生取樣在HPV檢測結(jié)果陽性時,可以用同一樣本進行細胞學檢測以實現(xiàn)風險分層和二次篩查,但自取樣本已被證實無法獲得滿意細胞制片,細胞學檢測效果差[29]。所以患者仍需再次前往醫(yī)院采集滿意細胞學標本。美國癌癥協(xié)會(ACS)2015年發(fā)布的宮頸癌篩查臨時指南開始推薦使用HPV16/18作為HPV陽性的分流指標[30]。目前多數(shù)自取樣篩查研究中涉及的基于PCR的HPV檢測技術,如Abbott RT HPV、MALDI-TOF-MS、Cobas 4800 HPV、HPV基因測序分型檢測技術(SEQ HPV)等均可報告HPV16/18的分型或其他單獨的高危亞型結(jié)果,因此結(jié)合不同地區(qū)HPV亞型與宮頸癌發(fā)病的相關程度,對這部分自取樣HPV16/18或其他高危亞型陽性進行分流和平衡篩查敏感性和特異性,提高篩查效率[31]。最近有研究報道,人類某些基因的超甲基化與宮頸癌的發(fā)病有強相關性,或可應用于自取樣本的 HPV陽性分流[32]。p16/ki67也是最近研究較熱的一組分子標記物,細胞免疫雙染對HPV感染者CIN2+/CIN3+的檢測有較高的敏感性和特異性。由于該分子染色不依賴細胞形態(tài)學,所以可適用于數(shù)目和質(zhì)量均要求不高的陰道自取樣本的檢測,未來有很大潛力成為自取樣HPV檢測陽性者的分流參考指標之一[33-34]。HC2雖被證實并不適用于自取樣本的檢測,但其檢測結(jié)果可反映出HPV感染的相對病毒載量,鑒于病毒載量與宮頸病變級別的高相關性[35],最近也有學者認為病毒載量檢測可用作HPV分型檢測后的二次篩查補充,這樣既可回避HC2檢測自取樣本的不敏感性,又可利用高病毒載量的對高級別宮頸病變的特異性,從而優(yōu)化各項篩查效果評定指標[36]。在此基礎上,Wu的研究團隊最近報道,可將Cobas 4800檢測中反映病毒拷貝數(shù)的循環(huán)閾值(Ct值)作為反映HPV病毒載量的指標,設定特定閾值進行對HPV陽性者的分流,并獲得了理想篩查效率[37]。上述研究為實現(xiàn)零細胞學的自取樣HPV檢測宮頸篩查模式提供了方向。

綜上所述,自取樣HPV檢測因其經(jīng)濟、方便、安全、保護隱私以及檢測準確等諸多優(yōu)點,在提高宮頸癌篩查覆蓋率、HPV疫苗接種或?qū)m頸病變患者干預后的隨訪等方面具有巨大潛力和應用價值。然而,自取樣HPV檢測作為初篩手段的宮頸癌篩查模式的建立,首先需要優(yōu)化組合自取樣本的采集、保存、檢測等各個環(huán)節(jié)。同時,在推廣實施前,還需要有經(jīng)過驗證的、合理有效的陽性者的分流方案來平衡篩查和衛(wèi)生經(jīng)濟學效益。