小細胞肺癌分子分型研究進展

徐夢圓 張俊文 蘇延軍 李西川

肺癌是當前世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。最新全球癌癥數(shù)據(jù)[1]顯示，2018年肺癌的發(fā)病率與死亡率分別為11.6%和18.4%。在中國，肺癌的發(fā)病率占所有癌癥病例的21.9%，位居所有惡性腫瘤發(fā)病率第一位[2]。其中小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）約占所有肺癌病理亞型的15%[3]。

1 SCLC的基本特征

SCLC是一種極具侵襲性和致命性的惡性腫瘤，與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）相比，具有倍增速度快、惡性程度高、較早發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移、易伴發(fā)內(nèi)分泌紊亂綜合征、初次化療敏感但易復發(fā)且獲得性耐藥、瘤內(nèi)血管密度高、失巢凋亡抵抗、基因組不穩(wěn)定和多種信號通路失調(diào)等特征，總體預后極差[4,5]。

根據(jù)臨床分期，SCLC可分為局限期（limited-stage,LS）和廣泛期（extensive-stage, ES），其中LS期患者約占所有SCLC患者的1/3，患者中位生存期（median survival time,MST）一般為15個月-20個月，而大部分患者在確診時已處于ES期，生存期一般為9個月-12個月，平均2年生存率低于10%[6,7]。當前對SCLC患者的治療一般不行外科手術(shù)，主要是以放療與化療相結(jié)合為主[6]，多數(shù)ES-SCLC患者在放化療結(jié)束的1個月-3個月后出現(xiàn)復發(fā)，且復發(fā)后出現(xiàn)對原化療藥獲得性耐藥，通過劑量強化難以獲得改善[8]。

目前對SCLC的診斷主要依靠血液腫瘤標志物檢測、計算機斷層掃描（computed tomography, CT）等影像學檢測和穿刺標本的病理學檢測來判斷。SCLC細胞主要的形態(tài)學特征包括燕麥狀小細胞、胞質(zhì)稀少、核質(zhì)明顯、邊界不清、胞內(nèi)具有顆粒狀染色質(zhì)、缺乏明顯的核仁等。腫瘤呈高分級、高增殖、高凋亡、高壞死，組織Ki-67染色陽性率為50%-100%[9]。

2 SCLC的分子分型

在幾乎所有SCLC病例中，抑癌基因TP53和RB1的失活普遍存在，表明TP53和RB1的雙失活是SCLC發(fā)生的必要條件之一[10]。由于TP53和RB1的普遍缺失和細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌上皮分化，SCLC最早被認為是分子同源的。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)不同的SCLC腫瘤間存在異質(zhì)性，甚至同一個SCLC患者的不同腫瘤細胞間也可能存在腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，因此將SCLC分為經(jīng)典型和突變型。隨后，根據(jù)腫瘤細胞是否具有神經(jīng)內(nèi)分泌狀態(tài)特征，將其分為神經(jīng)內(nèi)分泌型（neuroendocrine, NE）和非神經(jīng)內(nèi)分泌型（non-neuroendocrine, non-NE）。近年來，人們根據(jù)人原發(fā)性腫瘤組織、癌細胞系、PDX小鼠移植瘤和基因工程小鼠（genetically engineered mouse model, GEMM）的大量多組學測序數(shù)據(jù)和SCLC發(fā)生發(fā)展分子機制的深入研究，提出按照SCLC細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達差異進行分子分型。

Rudin等[9]分析了已發(fā)表的81例手術(shù)切除的、大多為LS-SCLC腫瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)，通過歸類分析發(fā)現(xiàn)SCLC的分子亞型可以由轉(zhuǎn)錄因子ASCL1、NEUROD1和POU2F3的差異性表達及其伴隨的炎癥基因表達來定義[11,12]。通過鑒定上述3種轉(zhuǎn)錄因子和炎癥基因的表達差異，可以將其區(qū)分為SCLC-A（高表達ASCL1）、SCLC-N（高表達NEUROD1）、SCLC-P（高表達POU2F3）和SCLC-I（3種轉(zhuǎn)錄因子均低表達，但炎癥基因高表達）四種分子亞型。

2.1 SCLC-A 生理狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子ASCL1在神經(jīng)干細胞等細胞中高表達，可誘導神經(jīng)元和中性粒細胞的分化。病理狀態(tài)下，ASCL1是一個特異性的癌基因，可以在SCLC細胞內(nèi)表達，是高級別SCLC的潛在治療靶點[9]。因此，將高表達ASCL1的SCLC亞型定義為SCLC-A。

ASCL1的表達與DLL3的表達密切相關(guān)，DLL3是編碼抑制Notch信號通路、抑制神經(jīng)元和NE細胞分化的抑制劑，并與REST的表達缺失密切相關(guān)。在SCLC中Notch通路的內(nèi)源性激活導致10%-50%的腫瘤細胞發(fā)生NE到non-NE的分化。該分化的起始部分由抑制NE基因表達的轉(zhuǎn)錄抑制因子REST/NRSF介導[13]。

2.2 SCLC-N 大部分的SCLC會表達ASCL1和NeuroD1兩種轉(zhuǎn)錄因子中的一種或兩種，其中約15%的SCLC細胞系和腫瘤會不表達ASCL1，只表達NeuroD1。因此將不表達ASCL1、只表達NeuroD1的SCLC亞型定義為SCLC-N。

NeuroD1的表達通常與ASCL1相關(guān)，但是這兩者對NE細胞有著不同的的靶向功能[9]。ASCL1靶向癌基因RET、SOX2和NFIB以及DLL3和DLL1等Notch通路中的多個基因；而NeuroD1則靶向MYC。在SCLC中會出現(xiàn)從ASCL1+轉(zhuǎn)變到NeuroD1+的現(xiàn)象[14]。這種ASCL1表達缺失在復發(fā)腫瘤中更為常見。在GEMM小鼠實驗[15]中發(fā)現(xiàn)，在MYC過表情況下，SCLC的GEMM腫瘤會表現(xiàn)出從ASCL1+/NeuroD1-的經(jīng)典形式到ASCL1-/NeuroD1+的變異形式的快速轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，并伴有NE細胞標記物丟失的現(xiàn)象。NEUROD1在非內(nèi)分泌肺癌細胞系中過表達會導致細胞增殖并激活NE轉(zhuǎn)化程序，且影響SCLC-N細胞的遷移能力[16]。此外，在SCLC細胞中的轉(zhuǎn)錄因子擴增方面，SCLC-A細胞系主要是MYC1擴增，具有典型的SCLC形態(tài)；SCLC-N細胞系則主要是MYC擴增，具有變異特征[16]。雖然在內(nèi)分泌SCLC中ASCL1與NeuroD1是必須的轉(zhuǎn)錄因子，但在高級別肺NE瘤小鼠模型中，ASCL1相比于NeuroD1更為重要。

2.3 SCLC-P Rudin等[9]的研究鑒定出過表達POU2F3的SCLC亞型，發(fā)現(xiàn)其是一種非神經(jīng)內(nèi)分泌型、非去甲腎上腺素（Non-NE、Tuft-cell）變體，將其定義為SCLC-P亞型。

生理狀態(tài)下，POU2F3通常在簇絨細胞中選擇性表達，而簇絨細胞是肺上皮中一種罕見的化學感應細胞類型[17]。病理狀態(tài)下，POU2F3一般在缺乏高水平ASCL1或NeuroD1表達的SCLC細胞系亞型中表達。表達POU2F3的SCLC細胞系缺乏典型的神經(jīng)內(nèi)分泌標志物，并表現(xiàn)出與簇絨細胞相似的表達圖譜，這表明SCLC可能存在多種起源細胞[18]。

2.4 SCLC-I 除了上述3種亞型外，還發(fā)現(xiàn)了一種沒有表達典型轉(zhuǎn)錄因子，但特異性表達許多免疫檢查點（immune checkpoint, IC）和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）基因的亞型，將其命名為SCLC-炎癥或SCLC-I。

SCLC免疫治療的臨床試驗[12]結(jié)果顯示，SCLC患者極少對免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade, ICB）藥物產(chǎn)生反應，部分原因可能是細胞毒性T細胞等免疫細胞的低滲透。但是在SCLC-I中CD8A和CD8B的表達明顯增高，說明該亞型有更多的細胞毒性T細胞浸潤。雖然每個亞型都有相似的免疫細胞類型，但SCLC-I中的T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等免疫細胞群的絕對數(shù)量顯著增加，且編碼HLAs和其他抗原呈遞機制的基因在SCLC-I亞型中的表達水平相對較高。此外，SCLC-I亞型細胞一般存在免疫檢查點分子高表達的現(xiàn)象，包括編碼程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1, PD-L1）的CD274、編碼其受體程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1, PD-1）的PDCD1、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA4）和編碼CTLA4配體的CD80、CD86等；而免疫檢查點CD38、IDO1、TIGIT、C10orf54（Vista）、ICOS和LAG3也經(jīng)常在SCLC-I亞型中高表達；干擾素基因刺激物（stimulator of interferon genes, STING）誘導的T細胞吸引趨化因子CCL5和CXCL10在SCLC-I中也存在高表達。這些高表達的免疫分子為ICB反應提供了良好的炎癥微環(huán)境。SCLC的ICB免疫治療臨床試驗的失敗可能與該試驗未區(qū)分患者不同的SCLC亞型有關(guān)，而SCLC-I亞型患者極可能在ICB治療中獲益。

上述各SCLC亞型中，SCLC-A和SCLC-N屬于NE類型，腫瘤細胞具有典型的神經(jīng)內(nèi)分泌特征，能夠表達嗜鉻粒素A（chromogranin A, ChgA）和突觸素（synaptophysin,SYP）等NE標志物；而SCLC-P和SCLC-I屬于Non-NE類型，不表達ChgA和SYP，但高表達REST等[12]。

3 對SCLC分子分型不同觀點的探討

Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1, YAP1）是Hippo生長信號通路激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在部分SCLC細胞中也存在高表達，有研究[14]把高表達YAP1的SCLC細胞定義為SCLC-Y亞型，但免疫組化的研究結(jié)果并不能支持將該類腫瘤作為獨立亞型進行分類，測序數(shù)據(jù)也顯示YAP1及其轉(zhuǎn)錄靶點在SCLC-P和SCLC-I兩種亞型中的表達高于SCLC-A和SCLC-N亞型。

通過對目前測序數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有SCLC細胞都表達ASCL1、NeuroD1、POU2F3和YAP1四種轉(zhuǎn)錄因子中的一種或多種；或者表達SCLC-I亞型的炎癥基因。原發(fā)性人SCLC組織中的甲基化組測序或RNA-seq的結(jié)果，進行一致性聚類的結(jié)果也基本都與上述四種亞型的分類結(jié)果一致。GEMM小鼠的數(shù)據(jù)[9]表明，MYC高表達的小鼠會向著NeuroD1-high方向發(fā)展；在條件性敲除Trp53/Rb1/Rbl2基因的GEMM小鼠中激活Notch通路，可以發(fā)展成ASCL1-low和NeuroD1-low的分型，并且人類腫瘤中Notch基因的失活突變可能會影響SCLC的亞型，導致腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生。

全基因外顯子組測序和100多例腫瘤全基因組測序的結(jié)果顯示，SCLC中抑癌基因TP53和RB1的失活幾乎普遍存在，但極少存在已知致癌基因的反復性靶向突變。研究發(fā)現(xiàn)MYC家族原癌基因拷貝數(shù)擴增，被抑制的表觀遺傳調(diào)控因子高頻突變以及Notch家族失活突變等現(xiàn)象。這些均是SCLC治療的靶向因子，深入研究這些靶向因子，將會在SCLC的診斷與治療上有更大的突破。

通過對SCLC的大量研究與測序數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，SCLC的發(fā)生與發(fā)展是由基因突變、拷貝數(shù)變異、轉(zhuǎn)錄組調(diào)節(jié)和表觀遺傳調(diào)節(jié)等多個方面共同調(diào)控的，其不同的調(diào)控因子的表達與基因的突變等均會影響SCLC的走向，形成不同的亞型。SCLC不同的分子分型更有利于前期精確診斷與治療，有助于提高SCLC患者的存活率。但在目前人們對于SCLC的分子分型仍不太清楚，后期還需要更加深入的研究。

4 SCLC分子分型的臨床研究

目前，SCLC的治療包括在LS-SCLC期行手術(shù)治療和放化療，在ES-SCLC期行放化療或聯(lián)合ICB治療[19]。隨著人們對SCLC分子分型研究的逐漸深入，未來可能會提出基于此的新興療法。目前，DLL3抑制劑、抗體藥物偶聯(lián)物、雙特異性T細胞誘導劑和嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T, CAR-T）細胞構(gòu)建物等都可用于SCLC-A的治療。特司林-洛伐妥珠單抗（rovalpituzumab teserine,Rova-T）是一種抗體藥物結(jié)合物，由一個針對DLL3的單克隆抗體、一個可拆分的蛋白酶連接物和一個吡咯環(huán)苯二氮雜卓（pyrrolobenzodiazepine, PBD）彈頭組成。在針對復發(fā)性SCLC的首次人體臨床試驗中，盡管產(chǎn)生嚴重的副作用，但是Rova-T還是有一定的效果。然而二期和三期臨床試驗結(jié)果不盡人意，所以終止了Rova-T的研發(fā)[20]。除了DLL3抑制劑，BCL2抑制劑因其可以靶向ASCL1，也可以用于SCLC-A的治療；但臨床上SCLC患者使用BCL2抑制劑治療的數(shù)據(jù)目前尚少[21]。有研究[22]顯示，黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性去甲基化酶LSD1（lysine-specific histone demethylase A1）在SCLC-A早期階段存在高表達，其抑制劑可能用于SCLC-A的治療，目前正處在早期發(fā)展階段。

小鼠模型中的研究[23]發(fā)現(xiàn)，MYC和NeuroD1高表達的SCLC-N亞型在聯(lián)合化療時對極光激酶AURKA抑制劑具有較高的敏感性，AURKA的擴增與紫杉醇耐藥有關(guān)，這也是聯(lián)合紫杉醇作為該亞型二線治療的原因之一。由于AURKA的磷酸化會導致LKB1的損傷，進而導致免疫治療耐藥；所以可以使用ICB和極光激酶抑制劑的聯(lián)合發(fā)揮作用。此外，SCLC-N可能對PI3K/mTOR通路抑制劑和HSP90抑制劑也具有敏感性[21]。據(jù)報道[18]，SCLC-P細胞系對IGFR1抑制劑敏感，但該抑制劑并沒有相關(guān)臨床研究。

5 總結(jié)和展望

鑒于SCLC的惡性程度較高、進展較快，臨床診斷的SCLC患者多處于ES期，存活時間較短。對SCLC進行分子分型及不同亞型的特性研究，有助于了解SCLC各不同亞型的生物學特性，確定不同亞型間的差異、共性和相互轉(zhuǎn)化的能力，進而找到影響不同亞型SCLC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。將SCLC分子分型的研究應用于臨床，將有助于提高醫(yī)生對SCLC患者的詳細診斷和治療方案的進一步優(yōu)化，從而延長患者生存時間并提高患者生活質(zhì)量。