液體活檢在非小細胞肺癌中的臨床應用進展

張敏 陳駿

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構發(fā)布，2020年全球肺癌發(fā)病率為11.4%，死亡率為18.0%，已成為惡性腫瘤致死的首要原因[1]。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的一種最常見的類型，約占肺癌總數的85%[2]。肺癌患者主要是通過組織病理活檢進行明確診斷，然而組織活檢具有較大創(chuàng)傷性且操作起來相對復雜，對于一些術后或轉移性肺癌患者來說，腫瘤體積太小或腫瘤位置不適合進行組織活檢。另外組織活檢只能反映腫瘤在某一時間點的局部狀態(tài)[3]，這樣可能會錯過某些腫瘤突變信息。液體活檢是指從體液中獲得來源于組織的生物標志物，并通過對所得的生物標志物進行分析得到其來源組織的相關信息[4]，在腫瘤領域具有巨大潛力和廣泛臨床應用前景。本文將從液體活檢在NSCLC的篩查、早期診斷、監(jiān)測病情變化、預測預后、探索耐藥機制以及肺癌疫苗的研制等方面進行闡述。

1 液體活檢主要檢測對象

1.1 循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）ctDNA是指人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征，包括突變、缺少、插入、重排、拷貝數異常和甲基化等來自腫瘤基因組的DNA片段[5]。ctDNA的主要來源包括：壞死的腫瘤細胞、凋亡的腫瘤細胞、循環(huán)的腫瘤細胞、腫瘤細胞分泌的外泌體。當癌細胞壞死或凋亡時釋放出漂浮在血液中的基因組片段即ctDNA。在晚期癌癥患者中，腫瘤可能是血液中大部分循環(huán)游離DNA（cell-free DNA,cfDNA）的來源[6]。ctDNA是一種敏感性和特異性較強的生物標志物，廣泛應用于多種不同類型腫瘤的臨床研究[7]。但由于ctDNA所占比例較小，從正常cfDNA中難以區(qū)分ctDNA，對樣本中突變片段數量進行準確定量存在困難，因此需要靈敏度和特異性較高的檢測方法[8]。過去DNA測序方法主要是第一代DNA測序方法和焦磷酸測序法。近年來，隨著二代測序（next-generation sequencing,NGS）技術和數字PCR（digital PCR, dPCR）技術的發(fā)展改變了檢測ctDNA的格局。目前，對于已知突變的ctDNA主要檢測技術有dPCR技術，基于小珠、乳濁液、擴增和磁性（bead, emulsion, amplification and magnetic, BEAMing）的技術以及突變阻滯擴增系統(tǒng)PCR（amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR）技術。而對于突變位點未知的主要使用標記擴增深度測序（tagged-amplicon deepsequencing, TAm-Seq）技術和癌癥個體化深度測序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPPSeq）技術。

1.2 循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs） CTCs是從原發(fā)性或轉移性腫瘤組織流入外周血液的罕見癌細胞。這些CTCs的表型和遺傳特征可以為指導癌癥分期和治療提供重要信息，因此進一步研究它們的特征和性質是一個相當有價值的領域，也為液體活檢提供細胞來源[9,10]。在外周血中，約每106個-107個白細胞中可能僅有1個CTCs[11]，因此CTCs富集分離是首要問題。CTCs檢測基本過程是先對其進行分離富集，再進行分析。富集和分析的方法基于CTCs的物理和生物學特性，例如大小、變形性、密度、極性和電荷、上皮細胞黏附分子、細胞角蛋白和表達的腫瘤相關標志物[12]。CTCs富集的方法主要有：密度依賴性細胞分離、基于細胞大小的分離、免疫磁珠陰性富集、基于磁泳移動性的分離、免疫磁珠陽性富集和通過微流體裝置富集。對CTCs進行分析的方法有：逆轉錄PCR技術、熒光原位雜交技術和熒光輔助細胞分選技術。另外可同時富集和分析CTCs的方法有：光纖陣列掃描技術、CellSearch、基于形態(tài)學富集的膜過濾技術（isolating by size of epithelial tumor cells,ISET）、AdnaTest和EPISPOT等。目前還有一些新興技術如利用聲波定向微流體將腫瘤細胞與白細胞分離，有助于我們快速準確地從全血中分離和分析CTCs[13]。

1.3 外泌體 1983年，外泌體最先在綿羊的網織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)[14]。外泌體是一種細胞源性囊泡，直徑為30 nm-100 nm，它可以從血漿、唾液、尿液、乳汁、胸水、腦脊液和精液等多種體液中檢測到其內含有的蛋白質（如細胞因子、生長因子）和miRNA等生物活性物質，通過對腫瘤外泌體的檢測分析可以得到腫瘤細胞的相關信息[15,16]。外泌體提取的方法有：差速超速離心法、PEG沉淀法、聲波分離法、密度梯度離心法、過濾離心法、吸附法和免疫磁珠法等。外泌體的鑒定方法包括：電子顯微鏡、免疫金標記技術、實時熒光定量聚合酶鏈式反應、流式細胞儀、納米顆粒追蹤分析技術和測序等。

2 液體活檢可用于NSCLC患者的篩查及早期診斷

NSCLC發(fā)病率和死亡率較高，且大部分患者在確診時分期較晚，因此篩查和早期診斷至關重要[1,2]。早期診斷和篩查常采用影像學方法，盡管低劑量螺旋計算機斷層掃描（computed tomography, CT）篩查靈敏度高，但其特異性相對較低，導致其過度診斷概率達18.5%[17]。現(xiàn)在液體活檢已被認為可以代替腫瘤組織，用于腫瘤相關遺傳和表觀遺傳改變的非侵入性檢測，并且已進入臨床應用[18-21]。Ilie等[18]進行了一項前瞻性研究，利用ISET技術檢測慢性阻塞性肺氣腫患者血液中的CTCs，并跟蹤隨訪入組患者1年-4年。結果發(fā)現(xiàn)CTCs陽性的患者中有5例患者通過CT掃描確定有肺結節(jié)，隨后的手術切除和病理檢查確診為早期肺癌；CTCs陰性的對照組在同一時期未發(fā)現(xiàn)肺癌。同樣有研究者招募了614例慢性阻塞性肺氣腫的患者，采集基線血液樣本，同樣利用ISET技術來檢測CTCs，然后進行跟蹤隨訪。研究[19]結果顯示，基線CTCs檢測對肺癌檢測的敏感性為26.3%，提示CTCs可以用作肺癌篩查的潛在生物標志物。

另外Jin等[20]通過分離血漿的腫瘤來源的外泌體，對60例參與者的miRNA-seq數據進行分析從而得到NSCLC早期診斷價值的評估，60例參與者中有43例是NSCLC患者，用于NSCLC診斷的miRNA在區(qū)分NSCLC患者和非NSCLC患者中的靈敏度為80.25%，特異性為92.31%。其中用于腺癌診斷的兩種miRNA（miR-181-5p, miR-361-5p）在區(qū)分腺癌患者靈敏度為80.65%，特異性為91.67%。用于鱗癌診斷的兩種miRNA（miR-320b, miR-10b-5p）在區(qū)分鱗癌患者靈敏度為83.33%，特異性為90.32%。另外有研究[21]發(fā)現(xiàn)在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，環(huán)狀RNA circSATB2在肺癌患者的血清外泌體中高表達，對臨床檢測具有高度敏感性和特異性。circSATB2可以被外泌體轉移，促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，并在正常人支氣管上皮細胞中誘導其異常增殖，與肺癌轉移有關?？梢娡ㄟ^對外泌體的分析有助于NSCLC患者的早期篩選和診斷，并且有助于鑒別腺癌和鱗癌患者。

3 液體活檢可用于監(jiān)測NSCLC患者病情變化

NSCLC患者可以發(fā)生復發(fā)、進展和轉移，有創(chuàng)的組織活檢只能反映腫瘤某一時間點的局部狀態(tài)，并不能完全代表患者的全部病情，且穿刺可能會引起種植轉移。臨床上主要是通過影像學檢查對腫瘤患者的治療效果進行評價。液體活檢可能允許患者在治療過程中實時取樣來評估病情，可實時監(jiān)測腫瘤在分子水平的動態(tài)變化，及時掌握腫瘤狀態(tài)和病情變化，提高療效評價的準確度，從而更好地調整治療方案[22]。Aggarwal等[23]的一項前瞻性研究納入了323例轉移性NSCLC患者，用NGS檢測患者血漿和組織的基因突變。其中94例患者只進行血漿檢測，31例患者檢測到可接受靶向治療的基因突變，因此無需進行侵入性組織活檢。有128例患者同時進行了血漿和組織的NGS檢測，8例在血漿中檢測到可靶向治療的基因突變，而其組織檢測結果為野生型，可見血漿檢測提高了檢測的突變率。對于無法進行組織活檢的101例患者，27例患者檢測到可治療靶向突變。在基于血液檢測結果接受靶向治療的42例患者中有36例實現(xiàn)了完全緩解、部分緩解和病情穩(wěn)定。這項臨床研究是衡量基于血漿的基因分型對NSCLC靶向治療的影響的研究之一，提示液體活檢提高了基因檢測的檢出率，可以作為一種重要手段以期提高靶向治療效果。

免疫檢查點抑制劑在晚期NSCLC患者中顯示出卓越的療效。免疫治療的選擇是基于通過免疫組化檢測腫瘤程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）表達，然而用于預測免疫治療療效的潛在生物標志物仍不確定。一項研究[24]測定血漿來源外泌體中PD-L1 mRNA水平與NSCLC患者免疫治療效果之間的關系。在基線和治療2個月后從患者血漿中提取外泌體，通過dPCR檢測PD-L1 mRNA表達水平，并對患者病情重新評估。結果顯示外泌體中PD-L1 mRNA水平根據腫瘤對藥物反應而發(fā)生變化，疾病進展的患者PD-L1 mRNA增加，而病情部分緩解或完全緩解的患者PD-L1 mRNA減少。接受免疫治療的NSCLC患者中外源性PD-L1表達發(fā)生了變化，并且可能與患者治療效果相關，證明了檢測血漿外泌體PD-L1的可行性及其與免疫治療效果的關系。免疫治療與抗血管生成治療的結合在多線治療中也顯示出很好的療效，有研究[25]納入了22例在化療、放療、靶向治療、手術和其他治療方法中均失敗的晚期NSCLC患者，這些患者接受卡瑞利珠單抗免疫治療聯(lián)合阿帕替尼抗血管生成治療。研究發(fā)現(xiàn)血液腫瘤突變負荷無法區(qū)分從這種聯(lián)合治療受益的患者，而ctDNA中變異等位基因則是治療效果的敏感指標，可用于監(jiān)測腫瘤的緩解或進展。另外，有研究[26]發(fā)現(xiàn)ctDNA測序可以在CT掃描診斷腫瘤復發(fā)前70 d檢測出NSCLC復發(fā)，并且可以識別原發(fā)性腫瘤的不同克隆以及轉移性腫瘤的分子變化。無論是靶向治療、免疫治療或聯(lián)合治療，液體活檢均發(fā)揮一定的價值。液體活檢的臨床應用可以減少患者再次組織活檢的有創(chuàng)損傷，可以實時監(jiān)測病情變化，甚至可以提前發(fā)現(xiàn)患者的病情進展。

4 液體活檢可用于預測NSCLC患者預后

早期肺癌患者術后復發(fā)是難以攻克的問題，有研究者從24例接受手術的I期-IIIa期肺癌患者收集術前血漿樣本，使用微滴式數字PCR技術分析血漿樣品的ctDNA，然后跟蹤隨訪目標患者至少2年。在術前cfDNA中可檢測到體細胞改變的7例患者中有2例發(fā)生了早期復發(fā)（2/7, 29%）。相比之下，手術時未檢測到ctDNA的12例患者中有2例在隨訪期內出現(xiàn)腫瘤復發(fā)（2/12, 17%）。術前ctDNA分析正確預測了一半的復發(fā)患者（敏感性為50%，特異性為67%）[27]。目前有大量研究顯示CTCs對各種類型實體瘤患者中的預后具有指導意義，Yoneda等[28]對94例手術完全切除的原發(fā)性肺癌患者進行長期隨訪并檢測CTCs。在16例患者中檢測到CTCs，CTCs陽性與無復發(fā)生存率呈負相關，CTCs陽性也與較差的總生存率相關，CTCs陽性與術后肺癌患者的無復發(fā)生存率和總體生存率低有關。可見液體活檢在早期肺癌患者預后方面表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。

液體活檢在預測晚期NSCLC患者預后方面也不可或缺。在接受化療的晚期NSCLC患者中，有研究發(fā)現(xiàn)CTCs數量可以提前預判出難以通過影像學檢測到的細微轉移和復發(fā)性腫瘤，與NSCLC患者預后密切相關，CTCs數量≤5個的患者的無進展生存期（progression-free survival, PFS）為11.3個月，而CTCs數量>5個的患者PFS僅為7.2個月[29]。另外，Coco等[30]為了研究cfDNA和CTCs在接受一線化療的NSCLC患者中的預后作用，納入了73例晚期NSCLC患者。在基線和2個化療周期后分析cfDNA和CTCs，通過qPCR進行血漿cfDNA定量。結果顯示基線cfDNA高于中位值的患者總生存期（overall survival, OS）明顯更差，死亡風險增加1倍。同時觀察到基線CTCs中位數與OS之間呈反比關系。此外，在病情穩(wěn)定的患者中，基線的cfDNA和CTCs能夠鑒別出高風險NSCLC患者，且在總體人群中cfDNA是比CTCs更可靠的生物標志物。在接受免疫治療的NSCLC患者中也同樣的發(fā)現(xiàn)CTCs計數以及代謝參數是PFS和OS的預后因素[31]。Nicolazzo等[32]招募了24例使用Nivolumab進行治療的IV期NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)CTCs的數量和其表面上的PD-L1的表達與患者的不良預后相關。另有數據[33]顯示ctDNA在早期治療時變化可能是免疫治療獲益的有用預測指標。在靶向治療方面，有研究者把154例接受吉非替尼治療的NSCLC患者作為觀察組，52名健康人作為對照組。研究結果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者治療前血漿cfDNA水平明顯高于對照組；在觀察組的NSCLC患者中，隨著病情嚴重程度的增加，cfDNA水平也逐漸升高；cfDNA低表達組患者的生存期明顯高于高表達組?？梢钥闯鯿fDNA濃度是影響NSCLC預后的獨立因素，血漿cfDNA是NSCLC患者的潛在預后指標[34]?？梢娨后w活檢可以應用于接受手術、化療、免疫治療和靶向治療的NSCLC患者，并且可以通過檢測cfDNA或CTCs等來進一步預測患者的預后。

5 液體活檢可用于探索NSCLC耐藥機制

腫瘤患者耐藥一直是難以突破的難題，尤其是靶向治療。靶向治療在具有特定突變基因的肺癌患者中有著顯著的臨床效果，但在治療過程中不可避免地發(fā)生耐藥，腫瘤異質性導致靶向治療期間多種耐藥機制的發(fā)展。因此，在NSCLC患者治療過程中基因突變動態(tài)縱向檢測，對于指導疾病進展或耐藥發(fā)生后的治療變得越來越重要。Tsui等[35]研究納入了接受吉非替尼和羥氯喹治療的50例表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變的NSCLC患者，縱向分析其中45例NSCLC患者的ctDNA動態(tài)變化。一組患者在疾病進展前后都保留EGFR敏感突變，其血漿樣本中檢測到T790M突變，表明至少有一些對TKI產生耐藥性的患者是通過T790M突變導致疾病發(fā)生進展的。在另一組患者中，進展前后都在血漿中檢測到EGFR突變，但沒有發(fā)生T790M突變，表明存在其他機制產生耐藥性。在余下的患者中，疾病進展時EGFR突變消失，也沒有在血漿中檢測到EGFR-T790M耐藥突變?？梢妼SCLC患者血漿ctDNA縱向分析揭示了耐藥機制的異質性，可以幫助確定耐藥機制，指導臨床治療。同樣CTCs作為識別基因突變的液體活檢的出現(xiàn)也為肺癌患者治療和監(jiān)測提供了新的機會。在間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）陽性肺腺癌的患者的CTCs中檢測到棘皮動物微管相關類蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4,EML4）-ALK基因重排。使用克唑替尼進行治療過程中，患者病情進展對ALK-TKI產生耐藥，此時從外周血CTCs中監(jiān)測到耐藥性基因突變，即ALK基因上的L1196M[36]。研究表明患者外周血CTCs的檢測可以解釋患者發(fā)生耐藥的機制并且為下一步治療的調整提供依據。

有研究者從T790M突變型NSCLC細胞株H1975和敏感細胞株PC9的條件培養(yǎng)基中分離出外泌體，并分析外泌體miRNA表達譜。發(fā)現(xiàn)H1975分泌的外泌體可通過激活PI3K/AKT信號通路體外使PC9獲得吉非替尼耐藥性。miR-3648和miR-522-3p是表達最差的兩個miRNA。功能研究[37]表明，miR-522-3p的上調可誘導PC9細胞對吉非替尼的耐藥性。研究的結果揭示了NSCLC中EGFR-TKIs獲得性耐藥的重要機制。NSCLC患者在治療期間會不可避免地出現(xiàn)特異性耐藥機制，使得通過再次進行組織活檢來獲得處于進展中的腫瘤組織變得至關重要。鑒于診斷樣本的缺乏和進行侵入性手術困難等問題，腫瘤組織并非總是可以獲得用于檢測耐藥，因此液體活檢的應用成為了克服這些困難的有效方法。

6 液體活檢可用于指導肺癌疫苗的研制

液體活檢除了可以用于NSCLC患者的篩查、早期診斷、監(jiān)測病情變化、判斷預后以及探索耐藥機制外，還可以指導肺癌疫苗的研制。細胞可以將細胞外囊泡釋放到周圍環(huán)境中以相互溝通，外泌體是細胞外囊泡的亞組，源自內吞途徑，它們含有可在細胞間轉移的RNA分子、蛋白質和脂質。已經有研究[38]證明外泌體具有調節(jié)免疫應答的能力，因此外泌體被認為是有益的癌癥和感染的無細胞疫苗。研究表明腫瘤細胞起源的外泌體、樹突狀細胞起源的外泌體以及腹水細胞來源的外泌體有可能為肺癌的疫苗研制帶來曙光。腫瘤來源的外泌體可以通過觸發(fā)更強的樹突狀細胞介導的免疫反應和減少腫瘤微環(huán)境中的調節(jié)性T細胞來改善疫苗介導的免疫治療[39]。樹突狀細胞起源的外泌體可以通過增強抗腫瘤T細胞反應、抑制癌細胞增殖以及根除腫瘤細胞從而增強肺癌患者免疫系統(tǒng)的反應[40]。此外，樹突狀細胞起源的外泌體具有比樹突狀細胞更長的體內半衰期，不受免疫調節(jié)劑的影響，并且沒有基于細胞的疫苗的風險。因此，可以進行臨床試驗以測試由攜帶腫瘤抗原的樹突狀細胞起源的外泌體組成的疫苗的可行性，安全性和功效[41]。

7 小結與展望

與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢技術具有便捷、無創(chuàng)性、可重復性等優(yōu)勢。諸多研究表明液體活檢作為精準醫(yī)療的新技術在腫瘤早期診斷、進展與轉移、異質性與耐藥性以及預后評估等領域具有獨特的技術優(yōu)勢和廣泛的臨床應用價值。通過檢測ctDNA、CTCs和外泌體等可以得到組織活檢無法實時提供的信息，并為實現(xiàn)肺癌患者的個體化診療提供有利的循證醫(yī)學依據，使患者受益。但在臨床中，不能單一的將某項指標作為評價標準，應該將液體活檢數據與組織活檢、影像學結果、腫瘤標志物等臨床指標相結合，綜合性地實時監(jiān)測指導NSCLC患者的臨床治療，為患者的實際情況提供更加精確的信息。

雖然cfDNA可以作為靶向治療患者的循環(huán)標志物，但CTCs、miRNA、外泌體和腫瘤血小板仍處于臨床前階段。盡管它們在篩選程序中作為預后、預測性生物標志物顯示出喜人的結果，但是仍面臨一些挑戰(zhàn)。一方面，ctDNA、CTCs和外泌體等在血液中含量較低，對檢測技術的靈敏度要求較高；另一方面，較高的檢測成本可能會影響液體活檢的廣泛應用，必須進行大型的前瞻性臨床試驗以提供其臨床效用的證據。相信隨著檢測手段的不斷進步、檢測靈敏度和穩(wěn)定性提高，檢測技術困難終將被攻克。屆時液體活檢技術能夠幫助在診斷和治療方面實現(xiàn)突破，同時能夠指導臨床方案的制定，實現(xiàn)真正的個體化精準醫(yī)療。