柞蠶微孢子蟲檢測(cè)方法概述*

劉 玲 楊曉瑜 程 明 鄭 丹 柯皓天， 任建宇 李瓊秀 杜國(guó)良

(1. 四川省絲綢工程技術(shù)研究中心，成都 610031；2. 四川省絲綢科學(xué)研究院有限公司，成都 610031；3. 四川省閬中蠶種場(chǎng)，四川 閬中 637400)

柞蠶微粒子病俗稱銹病、黑渣病等，柞蠶微孢子蟲(Nosemapernyi,Np)是引起柞蠶微粒子病的病原。Np孢子通過食下傳染和胚種傳染2種途徑致病，其中胚種感染的危害最大，一旦發(fā)生會(huì)給柞蠶種繁育和柞蠶繭生產(chǎn)帶來毀滅性經(jīng)濟(jì)損失，因此柞蠶微粒子病一直是柞蠶產(chǎn)業(yè)的重要檢疫病害。盡早針對(duì)柞蠶微孢子蟲進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)并阻斷其傳播，仍是生產(chǎn)上對(duì)柞蠶微粒子病的主要防控措施。本文簡(jiǎn)要介紹已有的檢測(cè)柞蠶微孢子蟲的4種方法，包括普通鏡檢法、常規(guī)PCR檢測(cè)法、膠體金免疫層析檢測(cè)法和熒光定量PCR檢測(cè)法，供生產(chǎn)上對(duì)柞蠶微粒子病的早期檢測(cè)診斷參考。

1 普通鏡檢法

自20世紀(jì)20年代開始，我國(guó)柞蠶業(yè)就在蠶種生產(chǎn)過程中對(duì)雌蛾抽樣后利用顯微鏡鑒定其是否含有Np孢子，進(jìn)而淘汰染病雌蛾產(chǎn)下的帶毒卵，這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)被稱之為普通鏡檢法[1-2]。直到現(xiàn)在，在采用卵面、蠶具及蠶場(chǎng)環(huán)境消毒等綜合防治措施中，普通鏡檢法仍然是控制柞蠶微粒子病暴發(fā)流行最有效的手段。

普通鏡檢法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、方便實(shí)用的特點(diǎn)。四川省通江縣柞蠶種場(chǎng)每年采用鏡檢法進(jìn)行的柞蠶雌蛾磨蛾集團(tuán)檢驗(yàn)，能將帶毒率控制在1‰以內(nèi)，并且可達(dá)到“兩降”(降低勞動(dòng)強(qiáng)度和檢驗(yàn)成本)、“兩省”(節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間，春季蠶種放養(yǎng)時(shí)間可提前5～6 d)、“三提高”(微孢子蟲檢出率提高、檢出準(zhǔn)確率提高、蠶種質(zhì)量有效提高)的效果。

但是，普通鏡檢法對(duì)鏡檢人員的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)技術(shù)水平要求較高，需要具備能準(zhǔn)確識(shí)別柞蠶微孢子蟲和辨識(shí)可交叉感染柞蠶的野外昆蟲微孢子蟲[3-4]的能力。

2 常規(guī)PCR檢測(cè)法

鄧真華等[5]利用常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)柞蠶微孢子蟲進(jìn)行了有效檢測(cè)。之前還有研究者采用稍加改進(jìn)的斑跡抽提法[6]成功提取到柞蠶微孢子蟲基因組DNA，采用的PCR擴(kuò)增引物為P1/P2和N1/N2，這2對(duì)引物是依據(jù)已報(bào)道的微粒子屬16S rRNA基因的保守序列[7-8]設(shè)計(jì)的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引物N1/N2的擴(kuò)增靈敏度比引物P1/P2的高。在總體積為25 μL的PCR反應(yīng)體系中，作為模板的柞蠶微孢子蟲基因組DNA的含量為0.47 ng時(shí)，引物N1/N2仍能擴(kuò)增出清晰的條帶，表明常規(guī)PCR技術(shù)在檢測(cè)柞蠶是否被柞蠶微孢子蟲感染具有較高的靈敏度。

由于柞蠶微孢子蟲具有一層幾丁質(zhì)外殼，一般化學(xué)物質(zhì)很難去除，采用SDS法、CTAB法等常規(guī)DNA抽提法得到的微孢子蟲基因組DNA在質(zhì)量方面很難達(dá)到檢測(cè)要求。采用斑跡抽提法[6]得到的DNA雖然能滿足PCR擴(kuò)增要求，但是提取步驟多、操作繁瑣，增加了時(shí)間成本。此外，PCR儀設(shè)備昂貴，許多柞蠶種場(chǎng)的財(cái)力尚不能承受此支出。這些都是應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)柞蠶微孢子蟲難以實(shí)用化的原因。

3 膠體金免疫層析檢測(cè)法

王伯陽(yáng)等[9]利用柞蠶微孢子蟲孢子液直接免疫家兔獲得柞蠶微孢子蟲多克隆抗體后，采用以下2種方法制作了膠體金免疫層析試紙條。

雙抗夾心法：將柞蠶微孢子蟲多克隆抗體與25 nm的膠體金顆粒結(jié)合并固定在金標(biāo)墊上，質(zhì)控點(diǎn)C上的物質(zhì)為羊抗兔二抗，檢測(cè)點(diǎn)T上的物質(zhì)為柞蠶微孢子蟲多克隆抗體。

競(jìng)爭(zhēng)法：將柞蠶微孢子蟲多克隆抗體與17 nm的膠體金顆粒結(jié)合并固定在金標(biāo)墊上，質(zhì)控點(diǎn)C同雙抗夾心法，柞蠶微孢子蟲孢壁蛋白作為檢測(cè)點(diǎn)T。

用2種試紙條同時(shí)檢測(cè)不同濃度的柞蠶微孢子蟲懸液，當(dāng)懸液中的Np孢子濃度達(dá)到8×106mL-1時(shí)，檢測(cè)10 min后，試紙條檢測(cè)線顯色趨于穩(wěn)定。對(duì)比2種試紙條的檢測(cè)結(jié)果，采用雙抗夾心法制作的試紙條顯色更清晰，因而結(jié)果更可靠，更具實(shí)用價(jià)值。

該方法具有結(jié)果直觀、特異性強(qiáng)、可檢測(cè)活體柞蠶微孢子蟲等優(yōu)點(diǎn)。但也存在2點(diǎn)不足：一是試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，靈敏度較常規(guī)PCR檢測(cè)法低；二是試紙檢測(cè)線顯色清晰度較差，需要進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件。

4 熒光定量PCR檢測(cè)法

米銳等[10]采用熒光定量PCR方法檢測(cè)柞蠶微孢子蟲的基因組DNA。實(shí)驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定熒光定量PCR的Ct值≤35作為檢測(cè)的敏感度區(qū)間，對(duì)柞蠶微孢子蟲基因組DNA的最低檢出限為0.004 6 ng，約為常規(guī)PCR技術(shù)檢出限(0.470 0 ng)的100倍。

采用熒光定量PCR法、普通鏡檢法和常規(guī)PCR法檢測(cè)相同的100粒柞蠶蛹樣品，3種方法檢測(cè)出的呈柞蠶微孢子蟲感染陽(yáng)性的樣品數(shù)分別為54個(gè)、2個(gè)和34個(gè)。作者還利用該方法和普通鏡檢法抽樣檢測(cè)生產(chǎn)中的柞蠶種繭和雌蛾，結(jié)果顯示，2種方法對(duì)柞蠶微孢子蟲感染陽(yáng)性檢出率差異顯著(P<0.05)。

熒光定量PCR是目前所有檢測(cè)方法中靈敏度最高的。然而此方法檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏度依賴于被檢測(cè)樣本的高質(zhì)量基因組DNA，采用斑跡抽提法[6]才能獲得高質(zhì)量的柞蠶微孢子蟲基因組DNA，但這種提取方法的弊端如前面所述。

此外，熒光定量PCR儀價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的專業(yè)技術(shù)水平要求較高，一般柞蠶種場(chǎng)沒有相應(yīng)的設(shè)備和技術(shù)人員，限制了該方法的大范圍應(yīng)用。