成骨過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)能量代謝研究進(jìn)展

葉嘉鵬 王建偉 馬勇 張亞峰 張強(qiáng) 張宗瑞 尹恒,* 肖吉日木圖,3 李紹爍

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210038 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214071 3. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010110

骨質(zhì)疏松癥是一個(gè)危害老年人生活質(zhì)量的公共健康問(wèn)題，骨的形成依賴于骨組織中產(chǎn)生足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞以及單個(gè)成骨細(xì)胞的活性[1]。成骨細(xì)胞能量代謝會(huì)影響其分化和功能。這些細(xì)胞用來(lái)產(chǎn)生ATP的物質(zhì)來(lái)源和途徑正在被廣泛研究，包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的代謝變化。細(xì)胞的變化如分化和增殖，可以引起新陳代謝的變化，也可以依賴于新陳代謝，不同的細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞自身的功能和環(huán)境表現(xiàn)出不同的能量供應(yīng)需求。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)分化為成骨祖細(xì)胞，再到極化、高度成熟的成骨細(xì)胞過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)代謝會(huì)不斷的改變，與細(xì)胞功能相適應(yīng)。

1 成骨細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖代謝

1.1 葡萄糖代謝途徑

葡萄糖代謝中糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、己糖胺生物合成途徑是較為常見(jiàn)的代謝途徑[2]，葡萄糖通過(guò)其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)糖酵解產(chǎn)生兩分子丙酮酸、兩分子ATP以及兩分子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。丙酮酸可以被乳酸脫氫酶(LDH)轉(zhuǎn)化為乳酸，這個(gè)反應(yīng)可以再生糖酵解所需的NAD+。丙酮酸還可以進(jìn)入線粒體通過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDH)脫羧形成乙酰CoA后進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)。TCA循環(huán)不僅通過(guò)氧化磷酸(OxPhos)化產(chǎn)生ATP，而且還提供中間分子參與細(xì)胞的生物合成。糖酵解中間產(chǎn)物還可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的其他代謝途徑，葡萄糖-6-磷酸(G6P)可以轉(zhuǎn)化為糖原儲(chǔ)存或通過(guò)磷酸戊糖途徑(PPP)代謝。PPP不僅產(chǎn)生合成核酸的5-磷酸核糖，而且還可以產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。來(lái)源于G6P的果糖6磷酸(F6P)可以進(jìn)入己糖胺生物合成途徑(HBP)，產(chǎn)生尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)用于蛋白質(zhì)糖基化。

1.2 成骨過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取

成骨細(xì)胞已經(jīng)被證明[3]表達(dá)幾個(gè)GLUT家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如 GLUT1、GLUT3和GLUT4 ，它們參與葡萄糖代謝和調(diào)控成骨細(xì)胞功能。GLUT1在成骨細(xì)胞譜系中表達(dá)水平最高，與Runx 2參與一種前饋機(jī)制，葡萄糖通過(guò)抑制AMPK依賴性的Runx 2蛋白酶體降解來(lái)促進(jìn)成骨分化，并通過(guò)抑制AMPK來(lái)促進(jìn)骨形成，其次還能通過(guò)誘導(dǎo)mTORC1介導(dǎo)的蛋白合成促進(jìn)膠原基質(zhì)的生成[4]。Mst1/2激酶在骨骼發(fā)育和重塑過(guò)程中是葡萄糖攝取所必需的，Mst1/2激酶穩(wěn)定了成骨細(xì)胞中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1，從而調(diào)節(jié)AMPK的活性，抑制GLUT1的表達(dá)會(huì)激活A(yù)MPK，并通過(guò)泛素化導(dǎo)致Runx 2的降解，從而減弱骨形成[5]。葡萄糖進(jìn)入骨組織還少部分受到胰島素的調(diào)節(jié)，喂食高脂飲食和具有成骨細(xì)胞特異性胰島素受體缺失的小鼠模型顯示，骨組織對(duì)葡萄糖攝取下降[6]。GLUT4 (由Slc2a4編碼)是原代成骨細(xì)胞分化過(guò)程中唯一表達(dá)增加的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，它需要胰島素的刺激來(lái)吸收葡萄糖，slc2a4缺失的原代成骨細(xì)胞顯示出由骨鈣素表達(dá)下降和胞外鈣流入減少，然而Slc2a4缺失的小鼠并沒(méi)有明顯的骨丟失，卻出現(xiàn)高胰島素血癥和胰島素抵抗[7]。

1.3 成骨過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的分解代謝

分化的成骨細(xì)胞的糖酵解和OxPhos水平都高于未分化的細(xì)胞，但OCR(耗氧率)/ECAR(細(xì)胞外酸化率)比率逐漸下降，分化后的細(xì)胞傾向糖酵解，即使在氧氣存在的情況下，也以糖酵解為主，這種現(xiàn)象類似于癌細(xì)胞中的Warburg效應(yīng)[8]。Guntur等[9]的研究同樣發(fā)現(xiàn)分化的MC3T3-E1成骨細(xì)胞主要通過(guò)糖酵解來(lái)滿足ATP的需求，而未分化的細(xì)胞則通過(guò)OxPhos化來(lái)產(chǎn)生ATP，但當(dāng)它們分化為脂肪細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)依然以O(shè)xPhos為主，這項(xiàng)研究說(shuō)明了不同的代謝譜和細(xì)胞分化的方向相關(guān)。人脂肪來(lái)源間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(adMSC)在非分化和成骨誘導(dǎo)條件下，糖酵解標(biāo)志酶磷酸果糖激酶(PFK)和戊糖磷酸途徑標(biāo)志酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)的含量增加，但在誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞形成時(shí)，伴隨細(xì)胞增殖的減弱，糖酵解能力降低，并誘導(dǎo)線粒體酶活性增加，OxPhos加強(qiáng)，說(shuō)明adMSC在成骨和成脂分化過(guò)程中能量代謝與特定細(xì)胞分化方向相適應(yīng)[11]。但為什么細(xì)胞依賴于糖酵解這種低效生成ATP的模式，Yang等[12]認(rèn)為氧糖酵解的必要性是需要以更快的速度產(chǎn)生ATP，提供代謝中間體來(lái)支持基質(zhì)蛋白的合成，增加進(jìn)入TCA循環(huán)的丙酮酸用于產(chǎn)生檸檬酸，這在結(jié)構(gòu)上對(duì)骨骼中磷灰石納米晶的形成具有重要意義。而Karner等[13]認(rèn)為這種代謝方式有助于成骨細(xì)胞分化的表觀遺傳調(diào)控。然而在人類間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)在成骨分化過(guò)程中，線粒體OxPhos的增加，其糖酵解水平和未分化的細(xì)胞相比無(wú)明顯改變[10]。Chen等[14]同樣發(fā)現(xiàn)未分化的hMSCs表現(xiàn)出較高水平的糖酵解酶和乳酸產(chǎn)率，在hMSCs成骨分化過(guò)程中，能量生產(chǎn)從糖酵解過(guò)渡到OxPhos。因此不同來(lái)源的細(xì)胞在成骨分化中有著不同的代謝方式。然而Pattappa等[15]和Esen等[16]使用了含有丙酮酸的培養(yǎng)基，丙酮酸可以直接進(jìn)入線粒體TCA循環(huán),人為地增加未分化細(xì)胞的耗氧量，因此在成骨過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)OxPhos的變化。

2 成骨細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸代謝

2.1 脂肪酸的代謝途徑

長(zhǎng)鏈脂肪酸的運(yùn)輸是由位于線粒體外膜和內(nèi)膜的雙肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT)介導(dǎo)的。脂肪酸通過(guò)脂酰CoA合成酶活化成脂酰CoA，穿過(guò)外膜，在肉堿的協(xié)助下，通過(guò)位于線粒體外膜的CPT1、內(nèi)膜的肉堿脂酰肉堿轉(zhuǎn)位酶和CPT2進(jìn)入線粒體基質(zhì)。脂肪酸通過(guò)活化成脂酰CoA在線粒體內(nèi)進(jìn)行β氧化(脫氫、加水、再脫氫、硫解)產(chǎn)生ATP。一個(gè)飽和脂肪酸氧化分解成乙酰CoA、NADH和FADH2，乙酰CoA進(jìn)入TCA循環(huán)，而NADH和FADH在電子傳遞鏈中生成ATP。單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸必須異構(gòu)化和還原，然后才能被β氧化。

2.2 脂肪酸的攝取

富含成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞的股骨干對(duì)乳糜微粒的攝取大于骨髓，表明正常的成骨細(xì)胞增殖需要血清脂蛋白[17]。成骨細(xì)胞表達(dá)低密度脂蛋白受體(LDLR)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)，LDLR的的消融導(dǎo)致與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)減少[18]。成骨細(xì)胞還表達(dá)高密度脂蛋白(HDL)的主要受體Scarb1[19]，BMSC中缺失Scarb1增加了成骨細(xì)胞形成，但降低了終末骨細(xì)胞分化[20]。但Tourkova等[21]報(bào)道缺乏Scarb1的小鼠在16周時(shí)骨吸收和骨形成的標(biāo)志物減少。此外骨吸收的脂肪酸很可能被代謝成ATP，因?yàn)轶w內(nèi)骨新合成脂肪的量很低[22-23]。成骨細(xì)胞還表達(dá)CD36直接攝取游離脂肪酸，CD36缺失小鼠骨形成率降低和成骨細(xì)胞分化障礙，但CD36在成骨細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)攝取的具體作用仍有待進(jìn)一步證明[24]。SLC27脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，也被成骨細(xì)胞用來(lái)獲得脂肪酸以供氧化[25]。

2.3 成骨過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的分解代謝

脂肪酸可以通過(guò)以下方式獲得：葡萄糖底物的從頭合成；膳食來(lái)源的乳糜微粒；脂肪細(xì)胞；細(xì)胞內(nèi)脂滴的脂解。成骨細(xì)胞表達(dá)高水平的GlUT1和CPT1a，表現(xiàn)出較高的耗氧水平以及代謝棕櫚酸酯的能力增強(qiáng)，表明其依賴脂肪酸氧化作用，下調(diào)CPT1a的表達(dá)會(huì)阻礙成骨細(xì)胞分化，而在骨折修復(fù)過(guò)程中局部注射游離脂肪酸會(huì)增加愈傷組織中形成的骨數(shù)量，減少軟骨數(shù)量，因?yàn)榈退降闹舅峒せ頕OXO3促進(jìn)軟骨形成[26]。研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中存在脂滴，未分化的BMSC含有很少的脂滴，而成骨誘導(dǎo)下第2天脂滴增加，7 d后更加明顯，并且檢測(cè)成骨基因的表達(dá)，用 CPT1抑制劑etomoxir (ETO)阻斷線粒體脂肪酸攝取，發(fā)現(xiàn)BMSC成骨分化第0天和第2天的OCR顯著降低，而在第7天成熟的BMSC的OCR略有下降，而ECAR沒(méi)有明顯改變，表明在BMSC成骨分化的早期脂滴的快速分解和利用產(chǎn)生ATP，成熟的成骨細(xì)胞似乎沒(méi)有以類似的程度利用脂肪酸，導(dǎo)致它們隨后的積累[27-28]。雖然在成骨細(xì)胞中脂滴分解的機(jī)制尚不清楚，但在其他組織中已被描述為通過(guò)兩種不同的機(jī)制發(fā)生：①脂滴相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)脂肪酶;②自噬小體隔離脂類并隨后被溶酶體酸性脂肪酶降解，稱為脂噬[29]，這兩個(gè)過(guò)程都導(dǎo)致游離脂肪酸的釋放。PAT家族中脂滴相關(guān)蛋白(PLIN1-5)的基因在BMSC中表達(dá)，值得注意的是PLIN2在第2天表達(dá)量最高，在第7天卻檢測(cè)到PLIN2的裂解物[28]。脂滴表面的PLIN2通過(guò)伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬(CMA)被降解，從而啟動(dòng)脂解[30]，此外PLIN2已被證明是蛋白酶體降解的靶標(biāo)[31]，這可能是檢測(cè)到PLIN2裂解物的另一個(gè)原因。Kim等[22]發(fā)現(xiàn)這些儲(chǔ)存的脂質(zhì)似乎不是成熟成骨細(xì)胞功能的主要能量來(lái)源，在體外培養(yǎng)的顱骨成骨細(xì)胞、成熟成骨細(xì)胞和體內(nèi)成骨細(xì)胞中，ATGL的表達(dá)均被阻斷，它能消除細(xì)胞內(nèi)脂解作用，但在體外成骨細(xì)胞性能和體內(nèi)骨結(jié)構(gòu)中均未發(fā)現(xiàn)缺陷。因此，成骨細(xì)胞似乎需要胞外的脂質(zhì)。然而未分化的BMSC中糖酵解對(duì)ATP產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率大于97 %，而葡萄糖和脂肪酸的氧化僅貢獻(xiàn)了ATP產(chǎn)量的3 %[32]，而且棕櫚酸酯還誘導(dǎo)BMSC凋亡和抑制增殖，但這種作用被不飽和脂肪酸油酸阻止。此外脂肪酸氧化也能減輕棕櫚酸酯對(duì)成骨細(xì)胞的負(fù)面影響[33]。

3 成骨細(xì)胞內(nèi)的氨基酸代謝

3.1 氨基酸的代謝途徑

氨基酸分為必需和非必需氨基酸,或者分為生酮和生糖氨基酸，是成骨細(xì)胞合成蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)生ATP的基礎(chǔ)原料。其中生酮氨基酸代謝為乙酰CoA或乙酰乙酸鹽，而生糖氨基酸則轉(zhuǎn)化為丙酮酸或TCA循環(huán)的中間體，包括草酰乙酸、戊二酸、富馬酸和琥珀酰CoA。因此，氨基酸可以通過(guò)TCA循環(huán)和OxPhos直接促進(jìn)ATP的產(chǎn)生。事實(shí)上，TCA循環(huán)中的氨基酸分解代謝在多能祖細(xì)胞維持和分化是必需的[34-35]。

3.2 氨基酸的攝取

對(duì)成骨細(xì)胞氨基酸攝取的初步研究定義了骨骼中的多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，包括系統(tǒng)A、L和ASC，并提出了成人和胎兒骨骼之間氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的差異，還發(fā)現(xiàn)cAMP、甲狀腺素、胰島素和IGF1在成骨細(xì)胞中調(diào)節(jié)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[36]。研究[37]表明，單個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與骨生物學(xué)有關(guān)，例如胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體XCT可能通過(guò)減少谷胱甘肽的產(chǎn)生來(lái)抑制成骨細(xì)胞的分化。ATF4轉(zhuǎn)錄調(diào)控一系列編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和氨基酸合成酶的基因，以增加氨基酸獲取，GCN2通過(guò)增加ATF4下游的氨基酸攝取來(lái)調(diào)節(jié)小鼠骨祖細(xì)胞(SSPC)的增殖，有利于維持骨穩(wěn)態(tài)[38]。

3.3 成骨過(guò)程中氨基酸的分解代謝

谷氨酰胺是血液中最豐富的氨基酸，谷氨酰胺通過(guò)谷氨酰胺酶(GLS)轉(zhuǎn)化為谷氨酸，然后轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸(α-KG)，進(jìn)入TCA循環(huán)，而且大部分TCA循環(huán)的碳和一些非必需氨基酸中的氮來(lái)自細(xì)胞中降解的谷氨酰胺[39-40]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞消耗的谷氨酰胺減少與衰老相關(guān)的成骨細(xì)胞分化受損有關(guān)[41]，成骨細(xì)胞內(nèi)的GLS和谷氨酰胺代謝可以促進(jìn)骨骼干細(xì)胞(SSCs)的增殖和向成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)基質(zhì)礦化以增加骨量[42]。有研究[43]表明，miRNA-206通過(guò)結(jié)合GLSmRNA，抑制GLS的表達(dá)和谷氨酰胺代謝，最終抑制BMSC的成骨分化。BMSC在成骨分化時(shí)代謝大量的谷氨酰胺，進(jìn)入TCA循環(huán)中提供ATP，而對(duì)檸檬酸的貢獻(xiàn)下降，谷氨酰胺還可以通過(guò)增加谷胱甘肽含量抵消ROS對(duì)成骨分化的不利影響。另外，與對(duì)抗ROS的積極作用相比，谷氨酰胺對(duì)BMSC成脂分化的影響較小，線粒體產(chǎn)生的ROS以mTORC1依賴的方式促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，這可以解釋脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中谷氨酰胺消耗和GLS活性相對(duì)于未分化的BMSCs沒(méi)有改變的現(xiàn)象[44-45]。而骨祖細(xì)胞的增殖似乎與谷氨酰胺相關(guān)性不大，這表明不同類型的細(xì)胞中谷氨酰胺代謝的不同作用[46]。同樣在ST2細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺分解代謝的增加促進(jìn)了細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物合成[47]。與預(yù)分化細(xì)胞相比，分化的脂肪細(xì)胞(3T3L1)特異性地利用了支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸[48]，這些氨基酸在成骨細(xì)胞分化中所起的作用目前尚不清楚。谷氨酰胺對(duì)骨骼中能量的產(chǎn)生和氧化還原平衡都起著關(guān)鍵作用，這可能是治療骨質(zhì)疏松癥的新策略。已有研究[41,49]報(bào)道衰老相關(guān)的谷氨酰胺代謝的改變可通過(guò)破壞谷氨酰胺代謝關(guān)鍵酶或線粒體代謝惡化來(lái)打破BMSC成骨分化和成脂分化之間的平衡。谷氨酰胺的前體2-氧化戊二酸(2-Ox)在胃底切除導(dǎo)致的骨量減少的骨骼中增加松質(zhì)骨、生長(zhǎng)板和關(guān)節(jié)軟骨的厚度[50]。它還應(yīng)用于糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥，提高了生長(zhǎng)激素和骨鈣素的濃度，并維持骨小梁的微結(jié)構(gòu)[51]。此外蛋白質(zhì)和氨基酸攝入可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增加骨密度，但過(guò)多攝入酸化氨基酸 ( 如半胱氨酸和甲硫氨酸) 會(huì)增加患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)[52-53]。

4 討論

盡管轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路已經(jīng)被廣泛研究，但對(duì)成骨過(guò)程中細(xì)胞代謝的狀態(tài)了解較少，由于體外實(shí)驗(yàn)無(wú)法完全模擬體內(nèi)骨髓環(huán)境，未來(lái)的研究需要進(jìn)一步明確成骨細(xì)胞在骨髓環(huán)境中不同分化階段的代謝表型。而代謝變化對(duì)成骨細(xì)胞分化和功能影響的分子基礎(chǔ)有待研究闡明。骨形成過(guò)程中葡萄糖、脂質(zhì)、氨基酸在細(xì)胞成骨過(guò)程中的動(dòng)態(tài)能量分配需要進(jìn)一步研究。此外，了解破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等其他骨組織內(nèi)細(xì)胞的生物能量學(xué)對(duì)于全面了解骨的代謝調(diào)節(jié)是很必要的。這些研究成果將來(lái)可以應(yīng)用于慢性代謝性骨病的治療，還能應(yīng)用于針對(duì)新靶點(diǎn)藥物的研發(fā)。