脊髓損傷相關(guān)信號(hào)通路在脊髓損傷修復(fù)過(guò)程中的研究進(jìn)展

敬 聰 王志剛 王 君 丁向前 鄒楊鴻 余化霖 耿 鑫

1.昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，云南昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外二科，云南昆明 650500

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約90%的SCI 是由交通事故、暴力、體育運(yùn)動(dòng)或跌倒等事件引起，以頸椎損傷最為常見(jiàn)，其中60%的SCI 患者年齡僅在15～35 歲。SCI 臨床結(jié)局取決于損傷的嚴(yán)重程度和位置，由于SCI 后軸突不會(huì)自發(fā)再生，往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，最嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致截癱[1]。SCI 是一個(gè)多種途徑、因素參與的復(fù)雜病理生理過(guò)程，不僅是原發(fā)性一次損傷及剪切、穿透或壓縮對(duì)脆弱神經(jīng)組織產(chǎn)生的破壞，隨之而來(lái)的水腫、脂質(zhì)氧化、炎癥、細(xì)胞毒性和微膠質(zhì)活化等還可誘發(fā)二次損傷，導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡和產(chǎn)生軸突脫髓鞘[2]。SCI 發(fā)生初期，大量炎癥反應(yīng)產(chǎn)生，最具特征性的改變是白細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，這些反應(yīng)會(huì)誘發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成及髓鞘源性抑制因子（myelin-associated inhibitory factors，MAIFs）產(chǎn)生。神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕雖然有利于控制炎癥和減少進(jìn)一步損傷，但會(huì)導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)錐塌陷，從而阻礙神經(jīng)元重建與修復(fù)。MAIFs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位周?chē)z質(zhì)瘢痕中高度表達(dá)，抑制受損部位少突膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化，使軸突再生減少，從而影響受損神經(jīng)的修復(fù)。目前SCI 主要治療方法都圍繞在受壓脊髓減壓、激素沖擊治療、康復(fù)鍛煉及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)藥物對(duì)癥支持治療[3]，具有一定的效果，但卻沒(méi)有在根本上解決SCI 修復(fù)的病理生理過(guò)程。隨著對(duì)本病深入研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）在各種信號(hào)通路的作用下可以定向增殖與分化，尤其是軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)束再生、少突膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的髓鞘形成，這些發(fā)現(xiàn)為SCI 的修復(fù)提供了重要依據(jù)[4]。本文對(duì)SCI 相關(guān)信號(hào)通路在SCI 修復(fù)過(guò)程中的研究成果和進(jìn)展作一綜述，希望可以為SCI 的治療開(kāi)辟新的視野。

1 Wnt 信號(hào)通路

1.1 Wnt 信號(hào)通路的來(lái)源

Wingless 基因最早在黑尾果蠅中被發(fā)現(xiàn)，其在果蠅胚胎發(fā)育中有重要作用，缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅無(wú)翅畸形。研究者[5]發(fā)現(xiàn)一個(gè)整合位點(diǎn)（integration，Int），將小鼠乳腺腫瘤病毒插入其中，可導(dǎo)致乳腺癌形成，將其命名為Int-1。Nusse 等[6]從多個(gè)物種的基因組DNA 與Int-1 低位雜交顯示這些基因從黑尾果蠅到人類(lèi)都表現(xiàn)為高度保守，能夠控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與成熟。Wingless 和Int-1 具有同源性，為了方便表示屬于這一系列的基因，于是將“wingless”和“integration”兩詞合并為Wnt。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)Wnt 家族的信號(hào)分子具有19 種Wnt[7]（分別是Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3、Wnt-3a、Wnt-4 等）和14 種已知受體[8][10 種Frizzleds（Fzds），Ryk，Ror1/2 和PTK7]。

1.2 Wnt 信號(hào)通路的機(jī)制

Wnt 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種功能，尤其在蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵過(guò)程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Wnt 信號(hào)通路參與神經(jīng)元分化、生成、存活、死亡、再生及突觸形成、延伸、重塑等過(guò)程。Wnt 信號(hào)通路分為兩類(lèi)[9]，第一類(lèi)是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路；第二類(lèi)是Wnt/Ca2+和Wnt/PCP 信號(hào)通路。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活從Wnt 配體與Fzd 受體的結(jié)合開(kāi)始，隨后Wnt-Fz募集支架蛋白質(zhì)DVL，產(chǎn)生一系列蛋白結(jié)構(gòu)變化[10]。同時(shí)，axin、腺瘤病大腸桿菌蛋白和GSK-3β 磷酸化后與β-catenin 結(jié)合增加，使β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子相互作用，導(dǎo)致Wnt 目標(biāo)基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄過(guò)程，促進(jìn)神經(jīng)再生。在Wnt/Ca2+途徑中[11]，主要是DVL 信號(hào)產(chǎn)生后，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而促進(jìn)對(duì)應(yīng)蛋白激酶激活。在Wnt/PCP 途徑中[12]，DVL 的Wnt-Fz 結(jié)合體依賴(lài)性募集會(huì)激活小GTPase 蛋白，例如Rho 和Rac，隨后會(huì)激活Jun-N 端激酶，后者又可以轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核或修飾細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。

1.3 Wnt 信號(hào)通路與SCI 修復(fù)

Wnt 信號(hào)通路具有刺激神經(jīng)生長(zhǎng)、發(fā)育的作用，尤其是胚胎時(shí)期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[13]。Strand 等[14]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號(hào)是幼年斑馬魚(yú)脊髓再生所必須的，隨后證實(shí)其在成年斑馬魚(yú)的脊髓再生過(guò)程中也高度表達(dá)。Wnt 具有維持人類(lèi)胚胎干細(xì)胞多能性及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生的作用，同時(shí)會(huì)促進(jìn)SCI 受損處NSC向神經(jīng)元分化，改善損傷處的傳導(dǎo)功能。李秋玲[15]發(fā)現(xiàn)，Wnt-3a 可以通過(guò)β-catenin 通路對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的分化起到調(diào)節(jié)作用，同時(shí)Wnt-3a 的表達(dá)會(huì)影響脊髓聯(lián)合纖維的生成。研究證實(shí)，利用Wnt 促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞，并將其移植到已形成神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的SCI 大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)損傷處的髓鞘再生，大鼠運(yùn)動(dòng)功能得到改善[16]。LINGO-1 可以與NgR/P75 結(jié)合形成復(fù)合體，該結(jié)合體的表達(dá)會(huì)促進(jìn)MAIFs 的表達(dá)，抑制軸突再生，產(chǎn)生髓鞘化。許剛等[17]研究表明，降低LINGO-1 的表達(dá)，使Wnt-7b 的表達(dá)升高，可以促進(jìn)脊髓源性NSC 的增殖增加。Li 等[18]研究利用Wnt-4修飾的NSC 移植可恢復(fù)SCI 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能。

2 Notch 信號(hào)通路

2.1 Notch 信號(hào)通路的來(lái)源

Notch 基因在突變的果蠅中發(fā)現(xiàn)，是一種膜受體，廣泛存在于不同生物體中，主要用于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育及凋亡等，尤其是在組織及器官的早期發(fā)育中起到重要作用。Notch 信號(hào)通路主要由Notch 受體、Notch配體蛋白、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子三部分組成。Notch 受體是在各種生物組織中廣泛表達(dá)，尤其是細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中。而Notch 配體則在不同物種中表達(dá)不一，如在果蠅中表達(dá)Delta、Serrate，而在線(xiàn)蟲(chóng)中表達(dá)LAG-2 和APX-1。

2.2 Notch 信號(hào)通路的機(jī)制

Notch 在各物種之間高度保守，是神經(jīng)發(fā)育的核心，決定NSC 增殖和神經(jīng)元分化的時(shí)間及其持續(xù)時(shí)間[19]，而且不同的刺激強(qiáng)度會(huì)誘導(dǎo)Notch 信號(hào)通路激活不同的路徑和動(dòng)態(tài)機(jī)制。在Notch 信號(hào)表達(dá)中，來(lái)自相同細(xì)胞型的受體和配體會(huì)產(chǎn)生旁抑制效應(yīng)，而不同細(xì)胞群受體和配體產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。旁抑制效應(yīng)是一種正反饋的機(jī)制，這種機(jī)制在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中會(huì)促使細(xì)胞向不同方向分化，尤其是NSC 分化[20]。細(xì)胞膜表面的Notch 分子與Delta 配體存在的相互抑制作用屬于旁抑制效應(yīng)。誘導(dǎo)效應(yīng)分為ADAM（S2 裂解）和g-分泌酶（S3 裂解）介導(dǎo)的兩個(gè)連續(xù)裂解步驟，導(dǎo)致Notch 胞內(nèi)段亞基釋放，在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子CSL 結(jié)合成復(fù)合體[21]，激活MAIFs 的目的基因，抑制神經(jīng)元再生。

2.3 Notch 信號(hào)通路與SCI 修復(fù)

Notch 信號(hào)是控制NSC 增殖、分化的關(guān)鍵機(jī)制之一。Notch1 缺陷使NSC 提前退出細(xì)胞周期，以犧牲膠質(zhì)細(xì)胞生成為代價(jià)開(kāi)始神經(jīng)發(fā)生，提示Noch1 在調(diào)節(jié)胚胎NSC 神經(jīng)元分化的發(fā)生中起著重要作用。Zhou等[22]在體外模擬SCI 微環(huán)境中證實(shí)脊髓提取物可以通過(guò)Notch1 和Hes1 促進(jìn)內(nèi)源性NSC 大量增殖。Notch 信號(hào)通路在脊髓源性NSC 分化成神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞中起到?jīng)Q定性作用[23]。同時(shí)，SCI 發(fā)生后，Notch信號(hào)表達(dá)的增強(qiáng)使得促神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的信號(hào)變得十分活躍，從而加速促進(jìn)NSC 向膠質(zhì)細(xì)胞的分化，且該過(guò)程呈不可逆趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄激活因子5（activating transcription factor 5，ATF5）在NSC 的增殖、分化中扮演重要作用，秦杰等[24]首次證實(shí)利用DAPT 抑制NSC中Notch 信號(hào)的表達(dá)會(huì)引起NSC 中ATF5 上調(diào)，使NSC 分化成神經(jīng)元。Li 等[18]研究證明，Notch 信號(hào)配體Jagged 的負(fù)效應(yīng)可以被Wnt-4 抑制，從而促進(jìn)NSC 向神經(jīng)元分化。

3 TGF-β/Smads 信號(hào)通路

3.1 TGF-β/Smads 信號(hào)通路的來(lái)源

TGF-β 具有多種生物學(xué)活性，與創(chuàng)傷的修復(fù)密切相關(guān)。TGF-β 家族由TGF-β 異構(gòu)體、抑制素、活化素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長(zhǎng)分化因子等30 多個(gè)因子組成，參與調(diào)節(jié)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種反應(yīng)，并在胚胎發(fā)育、組織分化中起到重要作用。TGF-β 有3 個(gè)亞型，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其在體內(nèi)的各種生物學(xué)活性卻不同。

1995 年，Sekelsky 等[25]先后證實(shí)果蠅的dpp 基因編碼的Smad4 類(lèi)同源蛋白（mothers against decapen taplegic，Mad）是一類(lèi)新的高度保守的蛋白家族，而Mad 參與TGF-β 家族的信號(hào)調(diào)節(jié)，并在多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演中心角色。1996 年，Savage 等[26]在研究TGF-β 信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)胞漿內(nèi)Sma2、Sma3、Sma4 蛋白為T(mén)GF-β 樣受體下游轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，參與信號(hào)調(diào)節(jié)的傳導(dǎo)，并證實(shí)其和Mad 蛋白在TGF-β 信號(hào)通路中作用與功能相似。

3.2 TGF-β/Smads 信號(hào)通路的機(jī)制

TGF-β/Smads 信號(hào)通路的主要成員有TGF-β、TGF-β 受體、各種Smads 蛋白及其核內(nèi)連接蛋白[27]。TGF-β 受體本身具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化的結(jié)構(gòu)域。其主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑如下：當(dāng)TGF-β 受體Ⅰ型、Ⅱ型被激活時(shí)，促使Smad2 和Smad3 蛋白激活，使其發(fā)生磷酸化，然后形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)相互結(jié)合后產(chǎn)生生物活性調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化產(chǎn)生影響。當(dāng)Ⅰ型受體被激活時(shí)，Smad6和Smad7 蛋白與其結(jié)合后會(huì)抑制R-Smads 的磷酸化過(guò)程，導(dǎo)致TGF-β 信號(hào)通路的減弱甚至被阻斷。

3.3 TGF-β/Smads 信號(hào)通路與SCI 修復(fù)

TGF-β1 由體內(nèi)大部分細(xì)胞合成分泌，在組織損傷時(shí)上調(diào)，通過(guò)刺激新的基質(zhì)蛋白生成，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，減少炎癥反應(yīng)，參與損傷組織的修復(fù)，SCI后2 d 就可檢測(cè)到TGF-β1 急劇升高[28]，而TGF-β2與TGF-β3 出現(xiàn)的時(shí)間則較晚，其主要作用是使膠質(zhì)瘢痕形成減少和小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活化增強(qiáng)[29]。O’brien 等[30]研究表明，在大鼠SCI 模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞與TGF-β 的表達(dá)增加呈正相關(guān)，后續(xù)發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smads 信號(hào)通路與SCI 的炎癥反應(yīng)和瘢痕形成密切相關(guān)。Kugler 等[31]的研究證實(shí)大鼠SCI 模型給予TGF-β治療后5 d，其后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較對(duì)照組效果明顯，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕增生較對(duì)照組更多。

4 mTOR 信號(hào)通路

4.1 mTOR 信號(hào)通路的來(lái)源

mTOR 信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中的靶點(diǎn)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3 激酶相關(guān)蛋白激酶家族，在細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡方面起到關(guān)鍵作用，并參與轉(zhuǎn)錄、mRNA 翻譯、自噬等生理過(guò)程。mTOR 信號(hào)通路也涉及神經(jīng)發(fā)育、通路形成、突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程[32]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，mTOR分為mTORC1 和mTORC2，mTORC1 對(duì)雷帕霉素的作用敏感，而mTORC2 對(duì)雷帕霉素具有抗藥性。mTORC1在抑制自噬的同時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)合成、核糖體生物生成和脂肪生成中起到積極的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，而mTORC2 則控制細(xì)胞生存、增殖[32]。

4.2 mTOR 信號(hào)通路的機(jī)制

mTOR 可對(duì)細(xì)胞外多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答，如生長(zhǎng)因子、胰島素、營(yíng)養(yǎng)素、氨基酸、葡萄糖等，主要通過(guò)經(jīng)典的PI3K/Akt/mTOR 途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，而PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的激活涉及膠質(zhì)瘢痕形成。結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物（tuberous sclerosis complex，TSC）是由TSC-1、TSC-2和TBC1D7 形成三聚體復(fù)合物，該復(fù)合物是Rheb 的抑制劑，而Rheb 是mTOR 活化所必需的，因此TSC 是mTOR 關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[33]。在NSC 中，mTORC1 的過(guò)度激活與TSC 低表達(dá)有關(guān)，而Akt 的活化可抑制TSC的形成，從而激活mTOR 信號(hào)通路，同時(shí)mTORC1 以通過(guò)抑制PI3K 信號(hào)和mTORC1 的激活來(lái)自我調(diào)節(jié)并形成負(fù)反饋回路。

4.3 mTOR 信號(hào)通路與SCI 修復(fù)

mTOR 信號(hào)對(duì)于控制干細(xì)胞增殖和分化至關(guān)重要。Ryskalin 等[34]研究表明，mTORC1 信號(hào)改變可導(dǎo)致NSC 的增殖增強(qiáng)，但不會(huì)促進(jìn)NSC 分化。mTOR 信號(hào)通路在SCI 不同時(shí)間段中發(fā)揮的作用也不相同。小鼠急性SCI 模型中抑制mTOR 能夠促進(jìn)自噬，顯著減少損傷處神經(jīng)元和神經(jīng)細(xì)胞死亡，抑制mTOR 會(huì)降低小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的促炎癥因子的表達(dá)水平。在亞急性/慢性SCI 模型中，利用Rapa 抑制mTOR 通路，可以抑制SCI 后新蛋白的合成和減低星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)軸突再生和髓鞘的形成，最終促進(jìn)SCI 修復(fù)。

5 結(jié)語(yǔ)

目前針對(duì)SCI 的治療研究主要是兩個(gè)方向：一是通過(guò)NSC 移植，使其分化成神經(jīng)元來(lái)治療；二是通過(guò)各種刺激，促使現(xiàn)有神經(jīng)元再生和增殖，進(jìn)而達(dá)到治療目的。無(wú)論哪一種方法都與信號(hào)通路密切相關(guān)，但對(duì)于移植NSC 來(lái)治療SCI 這種方法還存在著很多不可忽視的問(wèn)題，最核心原因還是內(nèi)源性NSC 不足，而利用胚胎干細(xì)胞又會(huì)引起倫理道德問(wèn)題。而且，體外長(zhǎng)時(shí)間人工培養(yǎng)擴(kuò)增NSC 的生物安全性也遭到質(zhì)疑。

調(diào)節(jié)信號(hào)通路來(lái)修復(fù)SCI 現(xiàn)在已成為前沿的研究課題，但其具體作用及機(jī)制尚未研究透徹，尤其是信號(hào)通路如何調(diào)控SCI 的修復(fù)，所以有廣闊的研究空間及前景，需要更加深入了解信號(hào)通路與SCI 的相關(guān)分子機(jī)制，為SCI 的臨床治療提供更加有意義的參考價(jià)值。