小檗堿對(duì)糖尿病認(rèn)知功能障礙模型小鼠AGEs/RAGE/NF-κB 信號(hào)通路的影響*

馬月娥，劉春秋

重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 萬州404000

近年來，我國(guó)糖尿病的發(fā)病率日益增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)達(dá)到1.09億人，到2040年我國(guó)糖尿病患者數(shù)量將達(dá)到1.51億人［1-2］。糖尿病會(huì)引起認(rèn)知功能障礙，已成為全球性醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)約有65%的2 型糖尿病患者伴有認(rèn)知功能障礙［3-5］。但目前尚無治療2 型糖尿病伴認(rèn)知功能障礙的有效藥物，因此亟待解決。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)AGEs/RAGE/NF-κB 信號(hào)通路是引起糖尿病伴認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制［6-7］。小檗堿（Berberine）為黃連中主要有效成分，具有廣泛的藥理作用，如降血糖、降脂、降膽固醇、抗炎、抗菌和拮抗神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的作用［8］。前期研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可緩解2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，但尚不能確定其是否是通過調(diào)節(jié)AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而改善認(rèn)知功能障礙［9-11］。為進(jìn)一步探明小檗堿改善糖尿病認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬采用腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病認(rèn)知功能障礙模型，用Real time-PCR和Western bolt檢測(cè)海馬中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）、晚期糖蛋白終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的基因和蛋白的表達(dá)，以期為小檗堿改善糖尿病認(rèn)知功能障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物70 只SPF 級(jí)雄性KM 小鼠，體質(zhì)量為20～25 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。喂養(yǎng)條件：溫度控制在23～25℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%。

1.2 藥品及試劑鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó)Sigam 公司，批號(hào)：18883-66-4）；小檗堿（上海源葉生物科技有限公司，純度：98%，批號(hào)：B21379）；葡萄糖測(cè)定試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為EBC-K234、E-EL-R0019c、E-EL-R0012c）；Trizol（美國(guó)Thermo Scientific，批號(hào)：15596018）；Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連Takara 公司，批號(hào)：RR430S）；SYBR Premix Ex Taq［TM］（大連Takara 公司，批號(hào)：638319）；一抗：AGEs（1∶1000）、RAGE（1∶1000）、NFκB（1∶1000），均為兔多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)分別為：sc-4527、sc-365154、sc-7178）；二抗，HRP 標(biāo)記山羊抗兔抗體（武漢谷歌生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180516）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器EnVision 型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer 公司），AL204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司），DU730 型核酸蛋白分析儀（美國(guó)Beckman coulter 公司），CFX96 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），Universal Hood Ⅲ型凝膠圖像成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模及分組 70 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，除空白組10只外，其他60只參考文獻(xiàn)［5］制作糖尿病認(rèn)知功能障礙模型：造模組進(jìn)食24 h后，一次性腹腔注射STZ 40 mg/kg，注射后第5 天禁食12 h后尾靜脈取血，測(cè)定葡萄糖含量，選取空腹血糖值大于11.1 mmol/L的小鼠，最終獲得符合條件的37 只小鼠為模型小鼠，分為模型組10 只，小檗堿低、中、高劑量組各9只。

1.4.2 給藥方法 小檗堿低、中、高劑量組分別按照按20、40、80 mg/（kg·d）的劑量灌胃小檗堿，模型組和空白組以等體積的生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)給藥30天。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 灌胃結(jié)束后12 h，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，前4天進(jìn)行獲得性訓(xùn)練，第5 天進(jìn)行正式檢測(cè)，檢測(cè)定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探查實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 小鼠海馬尼氏染色 行為學(xué)檢測(cè)完畢后，以6%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉（6 mL/kg），部分小鼠用4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注，待心臟發(fā)白后，端頭取腦，置4%多聚甲醛固定24 h，用尼氏染色觀察各組小鼠海馬病理形態(tài)變化。

1.5.3 ELISA 檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平 部分小鼠摘眼球取血，取血后置4℃離心機(jī)，以3500 r/min，離心半徑：14 cm，離心15 min，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平。

1.5.4 Realtime-PCR 檢 測(cè) 海 馬 中AGEs、RAGE、NF-κB mRNA 表達(dá)水平 取血后，斷頭取腦，冰上分離海馬，置液氮速凍，24 h 內(nèi)移至-80℃冰箱保存。取20 mg海馬，加Trizol提取海馬總mRNA，提取后用核酸蛋白儀檢測(cè)純度，純度為1.8～2.0 即可逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；參照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；參照SYBR Premix Ex Taq［TM］試劑盒說明書依次添加試劑，置PCR 儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。用2-△△Ct表示mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。AGEs、RAGE、NF-κB及內(nèi)參β-actin序列見表1。

表1 引物序列

1.5.5 Western bolt檢測(cè)海馬中AGEs、RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)水平 取海馬20 mg，加RIAP 裂解液和PMSF，冰上研磨，置4℃離心機(jī)，以12 000 r/min離心25 min，取上清，用BCA 蛋白質(zhì)試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度；制作SDS-PAGE凝膠，依次加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜；按抗體說明書孵育一抗AGEs、RAGE和NF-κB，置4℃冰箱過夜，洗膜，加入二抗，洗膜，ECL 顯色。最后置于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光各組蛋白條帶，拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白組比較，模型組小鼠上平臺(tái)潛伏期、游泳總路程和第1 次抵原平臺(tái)時(shí)間明顯增加（P＜0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間則明顯減少（P＜0.01）。與模型組相比，小檗堿高劑量組小鼠上平臺(tái)潛伏期、游泳總路程和第1 次抵原平臺(tái)時(shí)間均有不同程度減少（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間則有不同程度增加（P＜0.05）。小檗堿低、中劑量組小鼠上平臺(tái)潛伏期、游泳總路程和第1 次抵原平臺(tái)時(shí)間有不同程度較少，穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間有不同程度增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2—3。

表2 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表2 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：**表示與空白組比較，P＜0.01；#表示與模型組比較，P＜0.05

游泳總路程（cm）455.33±46.71 620.71±80.95**542.63±90.47 577.16±88.27 542.63±90.47#組別空白組模型組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組鼠數(shù)10 10 9 9 9上平臺(tái)潛伏期（s）36.37±12.91 68.57±21.77**55.48±18.22 59.46±19.62 50.61±16.81#

表3 各組小鼠空間探查實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表3 各組小鼠空間探查實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與空白組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

第1次抵原平臺(tái)時(shí)間（s）14.31±5.53 42.81±13.84**39.86±11.62 38.94±12.69 27.46±12.49##組別空白組模型組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組鼠數(shù)10 10 9 9 9穿越平臺(tái)次數(shù)13.36±2.87 6.48±2.72**7.89±2.95 8.35±3.88 9.15±3.02#目標(biāo)象限時(shí)間（s）38.12±12.36 20.42±8.57*29.74±9.71 29.81±15.06 33.08±5.73#

2.2 海馬尼氏染色空白組小鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元排列均勻整齊，細(xì)胞核飽滿，尼氏體染色均勻，大小均一。模型組小鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元減少，尼氏體固縮、深染。小檗堿高劑量組神經(jīng)元恢復(fù)較好，排列較整齊，尼氏體固縮、深染明顯好轉(zhuǎn)。小檗堿低劑量組和中劑量組神經(jīng)元也有所恢復(fù)，但不如高劑量組明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏染色圖（×200）

2.3 血清TNF-α、IL-1β水平與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，小檗堿高劑量組小鼠血清中TNFα、IL-1β表達(dá)下降（P＜0.05），小檗堿低、中劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β也有不同程度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較（±s）ng/L

表4 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較（±s）ng/L

注：與空白組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05

IL-1β 63.91±24.95 101.14±21.12**82.06±19.58 86.06±17.22 77.75±18.52#組別空白組模型組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組鼠數(shù)10 10 9 9 9 TNF-α 48.49±18.15 88.93±27.48**73.19±24.78 71.86±22.07 64.06±24.78#

2.4 海馬中AGEs、RAGE、NF-κB mRNA表達(dá)水平與空白組比較，模型組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NFκB mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿高劑量組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB mRNA 表達(dá)下降（P＜0.01，P＜0.05），小檗堿低、中劑量組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NFκB mRNA 也有不同程度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

2.5 海馬中AGEs、RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)水平與空白組比較，模型組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB的蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，小檗堿高劑量組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB 的蛋白表達(dá)下降（P＜0.01，P＜0.05），小檗堿低、中劑量組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB 的蛋白也有不同程度降低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6、圖2。

表5 各組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表5 各組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

組別空白組模型組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組NF-κB mRNA 0.58±0.31 0.91±0.36*0.74±0.26 0.69±0.22 0.64±0.25#鼠數(shù)10 10 9 9 9 AGEs mRNA 1.10±0.26 1.76±0.23**1.53±0.38 1.61±0.29 1.28±0.41##RAGE mRNA 0.74±0.31 1.07±0.37*0.84±0.19 0.99±0.17 0.79±0.31#

表6 各組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB灰度值比較（±s）

表6 各組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB灰度值比較（±s）

注：與空白組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05；與模型組比較，##表示P＜0.01，#表示P＜0.05

組別空白組模型組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組NF-κB 0.41±0.19 0.79±0.16**0.69±0.19 0.72±0.22 0.58±0.13##鼠數(shù)10 10 9 9 9 AGEs 0.61±0.19 1.06±0.32**0.86±0.29 0.95±0.33 0.81±0.23#RAGE 0.52±0.28 0.95±0.29**0.81±0.41 0.74±0.34 0.61±0.24#

圖2 各組小鼠海馬中AGEs、RAGE、NF-κB的蛋白條帶

3 討論

糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間高血糖狀態(tài)會(huì)促使葡萄糖發(fā)生糖化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生AGEs 及其中間產(chǎn)物甲基乙二醛（methylglyoxal，MG）［12］。AGEs 和MG 具有細(xì)胞毒性，可以毒傷神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡［13］。體內(nèi)沉積的AGEs 和MG 會(huì)促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起認(rèn)知功能障礙［14-16］。RAGEs是AGEs的受體，主要存在于巨噬細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞中，可以介導(dǎo)機(jī)體對(duì)AGEs 進(jìn)行蛋白修飾、蛋白降解及蛋白清除［17-18］。存在于錐體神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中RAGEs 能維持血腦屏障的完整性、減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)和Aβ的沉積［19-21］。AGEs 在腦內(nèi)過度沉積時(shí)，AGEs 會(huì)與其受體RAGE 結(jié)合，兩者結(jié)合后會(huì)激活氧化應(yīng)激，進(jìn)而激活氧化還原反應(yīng)敏感轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平升高，從而引起神經(jīng)突觸可塑性減低以及軸突樹突分支減少等，最終引起認(rèn)知功能障礙［22-23］。腹腔注射STZ 后，通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)小鼠上平臺(tái)潛伏期、游泳總路程和第1 次抵原平臺(tái)時(shí)間明顯增加，這說明本實(shí)驗(yàn)成功通過STZ 建立了糖尿病認(rèn)知功能障礙模型。腹腔注射STZ 后，小鼠血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平升高，海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元減少，尼氏體固縮、深染，海馬中AGEs、RAGE、NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)水平也升高，這說明STZ可以激活A(yù)GEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路，從而引起認(rèn)知功能障礙。

小檗堿為黃連的主要有效成分，具有降血糖、降脂、降膽固醇、抗炎、抗細(xì)菌和拮抗神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等作用［23］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予模型小鼠小檗堿后，小鼠神經(jīng)元恢復(fù)，排列較整齊，尼氏體固縮、深染好轉(zhuǎn)，血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)下降，海馬中AGEs、RAGE、NF-κB 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平也下降。這說明小檗堿能改善糖尿病認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與其下調(diào)AGEs/RAGE/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。