生、熟大黃對大承氣湯瀉下作用的比較研究*

曾海生，周歧驥，覃洪含，郭小葆，林 瑤，何思陸△

1 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色533000；2 右江民族醫(yī)學院

大黃屬中藥瀉下藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。大黃為唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.、蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖［1］。大承氣湯始載于漢代張仲景的《傷寒論雜病論》，由大黃、枳實、厚樸和芒硝組成，是瀉法的代表方劑［2］，具有瀉下熱結(jié)的作用，主治陽明腑實證和里熱實證等［3］。目前臨床上主要用于治療急腹癥、腸梗阻與胃腸道功能障礙等疾病。研究表明，該方還具有抑制血清內(nèi)毒素、降低炎性細胞因子水平、提高機體免疫力和調(diào)節(jié)胃腸激素分泌等作用，對腦、肺等臟器具有明顯的保護作用［4-10］。大承氣湯中大黃的瀉下活性成分為蒽醌類成分，以游離型與結(jié)合型兩種形式存在［11-14］。有文獻報道［15-18］，不同煎煮方法和煎煮時間對大黃及大承氣湯中蒽醌類成分的溶出量有顯著的影響，且能影響其藥效。本研究旨在探討大黃不同炮制品對大承氣湯瀉下作用的影響，為臨床合理使用生熟大黃提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物72 只清潔級昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半。實驗動物質(zhì)量合格證號：0001757，生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂2014-0002，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物及試劑生大黃、枳實、厚樸及芒硝購于廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室李斌副教授鑒定，大黃為蓼科植物藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖，枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果，厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮。以上三味中藥粉碎過10 目篩。芒硝，中藥名，經(jīng)鑒定為硫酸鹽類礦物芒硝族芒硝，為結(jié)晶體，主要含十水硫酸鈉（Na2SO4·10H2O）。酚酞片（山西亨瑞達制藥有限公司，批號：160702）；超微量Na+-K+-ATP 酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20170322）；考馬斯亮藍蛋白試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20170218）；生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1610060721）；試驗用水為純水。見表1。

表1 藥材批號與產(chǎn)地

1.3 實驗儀器UV-1800 型紫外分光光度計（日本島津公司）；20110793 型全波長酶標儀（美國，BIOTEK-Epoch）；PYX-190H-B 型育溫箱（廣東科力有限公司）；ZH-B6 型代謝籠（安徽正華有限公司）；41284881 型離心機（德國，Thermo Fisher）；HWS12型水浴鍋（上海一恒公司）等。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥液提取 采用上述藥材，按處方比例取厚樸藥材粉末24 g，枳實12 g，大黃12 g，芒硝9 g，分別精密稱定，厚樸與枳實加純水500 mL，浸泡30 min 后，加熱煮沸后保持微沸30 min，使用500目濾布過濾，剩下的藥渣再加純水500 mL后，浸泡30 min，然后加熱煮沸保持微沸30 min，再過濾，合并兩次濾液，然后加入大黃粉末，浸泡20 min后，再加熱煮沸，保持微沸20 min，使用500 目濾布過濾，藥渣再加入純水300 mL，加熱煮沸后保持微沸20 min，濾過，合并濾液，趁熱加入芒硝，攪拌使溶解，濃縮成濃度為0.3∶1的藥液（含生藥0.3 g/mL），置于2～8℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

同“1.4.1”項制備藥液方法，將藥液濃縮成濃度為0.5∶1的藥液（含生藥0.5 g/mL），置于2～8℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 分組及給藥 將健康昆明小鼠72 只適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天后，隨機分為：生大黃大承氣湯組（生DCQ 組）低（6 g/kg 灌胃）、高（10 g/kg 灌胃）劑量組，熟大黃大承氣湯組（熟DCQ 組）低（6 g/kg 灌胃）、高（10 g/kg 灌胃）劑量組，陽性對照組（酚酞片60 mg/kg灌胃），空白對照組（等量蒸餾水灌胃）共6組，每組12只。

1.4.3 小鼠瀉下指標觀察［19-20］實驗當日小鼠禁食不禁水4 h，空白組蒸餾水灌胃，其余組均給予對應(yīng)的給藥劑量（6 g/kg、10 g/kg），容積20 mL/kg。然后將實驗小鼠單獨放入代謝籠中（底下鋪有濾紙），然后觀察瀉下情況，按糞便性狀分為：水便、溏便、軟便、正常。水便和溏便為瀉下，分別觀察5 h 內(nèi)各組小鼠的瀉下只數(shù)、首次瀉下時間、瀉下總次數(shù)和總排便次數(shù)，比較生大黃與熟大黃的大承氣湯對正常小鼠排便的影響差異性。

1.4.4 小鼠腸道炭末推進率［21］按“1.4.2”項下的方法分組，各組分別給予上述加入墨汁的藥液灌胃給藥，16 min 后脫頸椎處死，解剖開腹，取出從幽門到回盲部的小腸（盲腸前端），按不加牽引地平鋪于干凈的玻璃板上，測量其全長和炭末前沿到幽門的距離，計算其與全長的百分比。

炭末推進率=炭末在腸內(nèi)推進距離（cm）/小腸全長（cm）×100%

1.4.5 小鼠結(jié)腸壁細胞Na+-K+-ATPase活性［22-23］按“1.4.2”項下的方法分組給藥，連續(xù)灌胃給藥6天，第6 天灌胃給藥30 min 后頸椎脫臼處死，馬上從回盲部下端剪取結(jié)腸，下列實驗操作都在冰水環(huán)境中進行，用預(yù)冷的蒸餾水反復(fù)清洗腸腔內(nèi)外血液和糞便，用濾紙稍微吸干，精確稱取0.2 g，然后加入生理鹽水1.8 mL，使用勻漿機，制備成10%質(zhì)量濃度比的勻漿液，2500 r/min，離心10 min，取上清液0.2 mL 加入0.8 mL 生理鹽水稀釋成2%體積比的勻漿，所得勻漿液在595 nm處，使用超微量Na+-K+-ATPase 試劑盒和考馬斯亮藍蛋白試劑盒測定其吸光度A，并計算樣本的蛋白濃度和ATPase活力。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瀉下指標首次瀉下時間、瀉下次數(shù)、總排便次數(shù)陽性對照組，生DCQ組低、高劑量組，熟DCQ組低、高劑量組均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中以生DCQ 組高劑量組顯著。首次瀉下時間、瀉下次數(shù)、總排便次數(shù)熟DCQ 組低、高劑量組均低于生DCQ 同劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中以熟DCQ 組高劑量組顯著。見表2。

表2 各組小鼠瀉下指標比較（±s）

表2 各組小鼠瀉下指標比較（±s）

注：與空白對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與生DCQ同劑量組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；-表示無數(shù)值

5 h內(nèi)總排便次數(shù)（次）9.42±1.18**12.54±1.89**7.68±1.75**△△9.72±1.96**△△11.73±2.01*4.08±1.67△△組別生DCQ組低劑量組生DCQ組高劑量組熟DCQ組低劑量組熟DCQ組高劑量組陽性對照組空白對照組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12首次瀉下時間（min）83.28±7.12**59.07±5.81**105.32±15.64**△△79.43±16.49**△△63.06±8.25**-5 h內(nèi)瀉下次數(shù)（次）8.96±1.99**9.63±2.78**6.91±1.25**△△7.86±1.87**△△9.32±2.56**-

2.2 小鼠腸道炭末推進率及Na+-K+-ATPase 活性炭末推進率陽性對照組，生DCQ 組低、高劑量組，熟DCQ 組低、高劑量組均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；炭末推進率熟DCQ低、高劑量組炭組均低于生DCQ 同劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Na+-K+-ATP 酶活力陽性對照組，生DCQ 組低、高劑量組，熟DCQ 組低、高劑量組均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ATP酶活力熟DCQ低、高劑量組炭組均低于生DCQ 同劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠炭末推進率及Na+-K+-ATPase活力比較（±s）

表3 各組小鼠炭末推進率及Na+-K+-ATPase活力比較（±s）

注：與空白對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與生DCQ同劑量組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

Na+-K+-ATPase活性（U·mg-1prot）1.49±0.85**1.18±0.37**1.77±0.54**△1.59±0.26**△△1.61±0.43**2.82±0.37△△組別生DCQ組低劑量組生DCQ組高劑量組熟DCQ組低劑量組熟DCQ組高劑量組陽性對照組空白對照組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12炭末推進率（%）79.12±3.61**87.06±3.71**72.13±4.73**△△80.93±3.32**△77.92±5.13**38.61±5.94△△

3 結(jié)論

本實驗選用經(jīng)典研究方法，觀察實驗藥物對小鼠瀉下作用、炭末推進率及Na+-K+-ATPase 活性的影響。通過與空白對照組、陽性對照組及生、熟大黃的大承氣湯組進行比較，探討生、熟大黃的大承氣湯的瀉下作用變化差異，為大黃不同炮制品對大承氣湯影響的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)。實驗根據(jù)相關(guān)文獻［24］與結(jié)合預(yù)實驗確定給藥劑量；酚酞為常用瀉藥，是臨床上常用于治療便秘的藥，能用于正常瀉下之用，故本試驗選擇使用酚酞作為陽性藥。

分別使用生、熟大黃的大承氣湯其瀉下作用總體上雖有一定的差異性，但其變化在一定程度上與大黃的不同炮制品對其方劑的影響存在著某些關(guān)系。生DCQ組、熟DCQ組與空白對照組及陽性對照組比較，其對正常小鼠正常瀉下作用、炭末推進作用、抑制Na+-K+-ATPase 活性的作用有差異性。有文獻報道［25］，大承氣湯的瀉下功效與總蒽醌成分有關(guān)，與空白對照組比較，使用生、熟大黃的大承氣湯對正常小鼠瀉下作用、炭末推進功能和Na+-K+-ATPase活性抑制率都具顯著性。

大黃不同炮制品在經(jīng)典組方“大承氣湯”中所起到瀉下功效變化的相關(guān)效應(yīng)，這些變化可能與生大黃和熟大黃的化學成分含量的轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化有關(guān)，在某些方面上具有一定的聯(lián)系和規(guī)律，至于生大黃與熟大黃對大承氣湯在人體內(nèi)這些變化是否會改變，有待進一步研究探索。

中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)極其復(fù)雜，其化學成分有黃酮類、酚酸類、皂苷類、生物堿、鞣質(zhì)等及蛋白質(zhì)、多糖、無機元素等。目前，中藥方劑配伍的化學成分的研究，大體上是在配伍前后方劑中個別化學成分的定量分析、方劑配伍后成分的含量變化及配伍后多成分定量分析研究［26-33］，而想在中藥方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)上有所突破，就要沖破目前研究方劑所固有的方法和思維模式，需要有創(chuàng)新性的方法和思維及深入的研究。