基于NF-κB/IRF4 信號通路研究龍葵總堿抗小鼠漿細胞骨髓瘤的作用*

劉 凱，王 躍，聶 甜，郝敬全，黃 蓉，江勁波

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙410208

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種惡性漿細胞腫瘤，是一種病死率較高的難治性血 液 惡 性 腫 瘤［1］。 西 醫(yī) 采 用 以 硼 替 佐 米（bortezomib，BTZ）、來那度胺為基礎的誘導/鞏固化療方案可最大程度地降低腫瘤負荷，或聯(lián)合造血干細胞移植以提高患者的遠期生存［2］。但是，部分患者易在維持治療階段復發(fā)或遠期復發(fā)。中醫(yī)藥對該病的防治取得了一些初步療效。大量研究表明［3］，龍葵總堿（龍葵的提取物）對于多種腫瘤有明確的增殖抑制作用。本課題組前期使用含龍葵的中藥復方治療MM，患者遠期生存率有所提高［4］。龍葵總堿是從龍葵中分離出的活性生物堿，在MM 中的治療中發(fā)揮著較大作用。本研究從NF-κB/IRF4 信號途徑促進骨髓瘤細胞凋亡為切入點，運用蛋白免疫印跡等分子生物學方法，研究龍葵總堿對NF-κB/IRF4 信號途徑各信號靶點分子的作用，以期闡明龍葵總堿促骨髓瘤細胞凋亡的作用機制，為MM 維持階段的新藥開發(fā)提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4周齡SPF級BALB/c裸鼠90只，體質量15～20 g，均為雌鼠，購自上海寶特生命科學發(fā)展有限公司，實驗動物許可證號：SYXK（湘）2013-0005。

1.2 藥物與試劑RPMI-8226 骨髓瘤細胞株（武漢興旺生物科技有限公司，批號：5078）；硼替佐米注射劑（西安楊森制藥有限公司，批號：160823591，規(guī)格：1.0 mg/支）；龍葵總堿（蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司，批號：20170602）；RPMI1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號：YXQ-511）；胎牛血清（Gibco 公司，批號：SH30070）；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：C1062M）；彩色預染蛋白marker（江蘇碧云天，批號：P0078），RIPA蛋白裂解液產品來（Fermentas，批號：P0013E），Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天有限公司，批號：P0006）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（南京諾維贊生物科技有限公司，批號：ab9810）；NF-κB（P65）轉錄因子試劑盒（ImmunoWay，批號：YT2306）；人IκB激酶-α（inhibitor kappa-B alpha，IκB-α）試劑盒（Immuno Way，批號：YT2417）；人磷酸化IκB 激酶-α（p-IκB-α）試劑盒（批號：ImmunoWay，YP0151）；干擾素調節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）試劑盒（ImmunoWay，批號：YP0151）；人β 肌動蛋白（β-actin）試劑盒（Abcam，批號：ab8226）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將RPMI-8226 骨髓瘤細胞株加入含10%胎牛血清加雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）的RPMI 1640 培養(yǎng)液內，置于5% CO2及37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 造模與分組

1.3.2.1 造模 除空白組外，其余各組裸鼠均采用劉瑜法［5］建立骨髓瘤移植小鼠模型，通過傳代，擴增，收集呈對數生長期的細胞制成單細胞懸液，SPF 環(huán)境下在每只裸鼠右前肢外側皮下接種細胞懸液6×105/0.2 mL。造模成功的標準：取瘤組織進行病理檢測，HE染色后見大量原始、幼稚漿細胞聚集分布，免疫組織化學染色后見漿細胞CD138（+）或κ輕鏈（+），血清免疫固定電泳檢測到M蛋白。

1.3.2.2 分組 以非造模裸鼠為空白組，模型組隨機分成5 組?？瞻捉M［生理鹽水10 mL/（kg·d），灌胃］，模型組［生理鹽水10 mL/（kg·d），灌胃］，硼替佐米組［硼替佐米0.1 mg/（kg·d），皮下注射］，龍葵總堿高［龍葵總堿50 mg/（kg·d），灌胃］、中［龍葵總堿25 mg/（kg·d），灌胃］、低［龍葵總堿12.5 mg/（kg·d），灌胃］劑量組，每組15只。連續(xù)灌胃14 天（20 g 小鼠龍葵的累及致死量為30 mg）［4］；連續(xù)皮下注射14天，每日2次，每次0.1 mL。

1.3.3 CCK8 檢測細胞增殖抑制率 先將模型組小鼠的新鮮瘤體組織剪成1～2 mm2大小，放入組織研磨器中加入1～2 mL 生理鹽水；轉動研磨，研至勻漿；加入10 mL生理鹽水，沖洗研磨器；離心后收集瘤細胞懸液，棄上清，先用預冷PBS 收集細胞，再用改良型1640 培養(yǎng)基將細胞密度調整至1×105個/mL，每孔50 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板（即每孔0.5×104個/mL），即在RPMI8226 細胞中所需濃度為：分別設空白組（僅有培養(yǎng)基）、對照組（50 μL 培養(yǎng)基+50 μL 細胞）、藥物組（50 μL 龍葵總堿+50 μL 細胞），在藥物組分別加入50 μL 已配置的不同濃度龍葵總堿（50 mg/L、25 mgl/L、12.5 mg/L），每個濃度設5 個復孔，種于96 孔板，置于37℃、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h。每孔加入10 μL 試劑盒中7sea-cell counting kit 溶液，同步設調零孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光值（OD）。

1.3.4 流式細胞分析法檢測細胞凋亡率 同上取瘤組織細胞，加入500 μL的Binding Buffer至懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL Propidium Iodide（PI），混勻；室溫、避光、反應5～15 min；在1 h之內進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.3.5 采用Western blot檢測p-IκB-α、NF-κB、P65 與IRF4 表達量 把組織塊放入勻漿器內，用干凈的剪刀盡量剪碎。剪碎勻漿器內的組織，加入RIPA 裂解液，盡量碾碎組織，30 min 后用移液器移至1.5 mL 離心管中，勻漿器內加入適當RIPA裂解液（含1%PMSF），置于冰上進行勻漿。每20 mg組織加入0.15～0.25 mL裂解液。4℃條件下，離心半徑：13.5 cm，12 000 r/min，離心5 min，取細胞全蛋白即上清液，分裝于1.5 mL離心管中，-20℃保存，采用Bradford 法測定蛋白質含量（制作標準曲線和檢測樣品蛋白含量），采用SDS-PAGE 凝膠電泳（清洗玻璃板和灌膠與上樣），后在PVDF 膜上墊3張濾紙，然后將凝膠平鋪于PVDF 膜上，加入用封閉液稀釋的一抗，25℃孵育1 h，加入羊抗兔或抗鼠的第二抗體，同樣用封閉液稀釋，稀釋比為1∶2000，37℃孵育1 h。再次洗膜后通過顯色儀器進行ECL 顯影。采用美國Bio-RadChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)，成像圖片利用圖像分析軟件IPP 6.0，對圖像進行累積光密度（IOD）分析。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0 軟件進行數據處理與分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析；計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨髓瘤細胞增殖活性與模型組比較，硼替佐米組，龍葵總堿高、中、低劑量組對骨髓瘤細胞抑制率均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與龍葵總堿低劑量組比較，硼替佐米組、龍葵總堿高劑量組對骨髓瘤細胞的抑制率均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；硼替佐米組與龍葵總堿高劑量組對骨髓瘤細胞的抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；硼替佐米組，龍葵總堿高、中、低劑量組在48 h與72 h時對骨髓瘤細胞的抑制率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示龍葵總堿具有明顯的抑制增殖效應，且呈時間依賴性。見表1。

2.2 骨髓瘤細胞凋亡與模型組比較，硼替佐米組，龍葵總堿高、中、低劑量組瘤細胞凋亡率均增高（P＜0.05）。與龍葵總堿低劑量組相比較，硼替佐米組、龍葵總堿高劑量組瘤細胞凋亡率均增高（P＜0.05）。龍葵總堿高劑量組與硼替佐米組比較，瘤細胞凋亡率無差異（P＞0.05），提示龍葵總堿具有明顯的促細胞凋亡作用，且呈劑量依賴性。見表2、圖1。

2.3 骨髓瘤細胞p-IκB-α、NF-κB.P65 與IRF4 表達與模型組比較，硼替佐米組、龍葵總堿高、中劑量組p-IκB-α、NF-κB與IRF4表達均減少（P＜0.05），而其負調控因子IκB-α 水平升高（P＜0.05）。與龍葵總堿低劑量組比較，龍葵總堿高劑量組、硼替佐米組瘤細胞p-IκB-α、NF-κB P65 與IRF4 表達均減少（P＜0.05）。與硼替佐米組比較，龍葵總堿高劑量組瘤細胞p-IκB-α、NF-κB、p65 與IRF4 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示龍葵總堿抑制骨髓瘤細胞IκB-α 磷酸化，引起NF-κB 失活，減少瘤細胞IRF4 表達，說明龍葵總堿能通過抑制IκB-α 磷酸化和NF-κB/IRF4信號通路促進骨髓瘤細胞凋亡，且呈劑量依賴性。見表3、圖2。

表1 各組小鼠骨髓瘤細胞增殖活性比較（±s） %

表1 各組小鼠骨髓瘤細胞增殖活性比較（±s） %

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01；與硼替佐米組比較，Δ表示P＜0.05，○表示P＞0.05；與龍葵總堿低劑量組比較，●表示P＜0.05

組別模型組硼替佐米組龍葵總堿低劑量組龍葵總堿中劑量組龍葵總堿高劑量組鼠數15 15 15 15 15 48 h 72 h抑制率（%）1.12±0.74 27.38±1.67#●11.59±1.79*Δ 16.77±1.53#Δ 28.61±2.98#○●吸光度0.717±0.006 0.574±0.015 0.689±0.033 0.624±0.021 0.569±0.018抑制率（%）0.89±0.26 19.89±2.13*●3.79±4.57*Δ 6.58±3.52*Δ 20.61±2.54#○●吸光度0.748±0.006 0.547±0.012 0.587±0.013 0.569±0.009 0.534±0.022

表2 各組小鼠RPMI-8226骨髓瘤細胞凋亡率比較（±s）

表2 各組小鼠RPMI-8226骨髓瘤細胞凋亡率比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05；與硼替佐米組比較，Δ表示P＜0.05，○表示P＞0.05；與龍葵總堿低劑量組比較，●表示P＜0.05

凋亡率0 13.4±2.14 41.5±2.78*●24.8±0.74*Δ 33.2±1.49*Δ 46.7±0.97*○●組別空白組模型組硼替佐米組龍葵總堿低劑量組龍葵總堿中劑量組龍葵總堿高劑量組鼠數15 15 15 15 15 15

表3 各組小鼠瘤組織細胞蛋白相對含量比較（%）

圖1 各組小鼠骨髓瘤細胞凋亡率（Q2和Q3為凋亡細胞）

圖2 各組小鼠β-actin、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB、P65、IRF4表達

3 討論

MM 的自然病程個體差異較大，具有明顯差異性［6-7］，且尚無法治愈，臨床治療的目的是實現(xiàn)嚴格的完全緩解、分子水平緩解，減少其復發(fā)、改善其生存質量。

中醫(yī)學在治療MM 方面具有獨特的優(yōu)勢，多發(fā)性骨髓瘤依據其臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學“骨痹”“骨蝕”等范疇。中藥龍葵（solanum nigrum）具有軟堅散結的作用，龍葵總堿（生物堿）是龍葵抗腫瘤的主要成分，對胃癌、肝癌、白血病等具有廣泛的抗腫瘤活性［8-9］。

前期研究表明，NF-κB 信號通路激活是骨髓瘤細胞凋亡受抑的重要機制［10-12］。在NF-κB 信號通路中，其活化與IκB 激酶（IκB kinase，IKK）起了決定性的作用，在上游各種活化信號的刺激下，IKK 激酶復合物中的IKKγ作用于下游的IκB-α，將其磷酸化后降解IκB-α，從而釋放出NF-κB，NFκB 活化后在核定位信號的介導下轉位入核，啟動下游靶基因的活化。而IRF4 是NF-κB/IRF4 信號通路下游重要的靶基因［13］，在多發(fā)性骨髓瘤細胞中，IRF4 基因過度表達，使得患者體內腫瘤性漿細胞負荷增高［14］。

在本實驗中，將不同濃度的龍葵總堿干預骨髓瘤小鼠進行瘤組織分離，并予以NF-κB、P65、IRF4、IκB- α、p-IκB- α 蛋 白 的 提 取 并 進 行Western blot 方法檢測蛋白，結果提示龍葵總堿處理后細胞中NF-κB P65、IRF4、p-IκB-α 蛋白表達量明顯降低，而負調控因子IκB-α 水平明顯升高，其機制為下游的IκB-α 蛋白被磷酸化后降解IκB-α，從而釋放出NF-κB，NF-κB活化后在核定位信號的介導下轉位入核，啟動下游靶基因的活化，IRF4是NF-κB/IRF4信號通路下游重要的靶基因，入核后的NF-κB 可與IRF4 基因的啟動子結合，增加IRF4 基因的轉錄這說明龍葵總堿對于多發(fā)性骨髓瘤細胞的促凋亡作用與轉錄因子IRF4 蛋白和NF-κB 家族中的主要調控抑制凋亡蛋白P65 的下調有關。

綜上所述，龍葵總堿通過抑制磷酸化IκB-α，引起NF-κB失活，促進骨髓瘤細胞IRF4表達減少，從而促使骨髓瘤細胞凋亡，其促骨髓瘤細胞凋亡和抗骨髓瘤細胞增殖效應呈劑量與時間依賴趨勢。本研究為更全面地闡釋龍葵總堿抗多發(fā)性骨髓瘤的作用機制，及進一步為尋找中藥治療MM 的作用靶點研究提供了客觀的實驗依據。