支氣管哮喘分期對(duì)誘導(dǎo)痰IL-4水平及炎癥細(xì)胞分型的影響研究

劉慧，許碩，徐玉輝

(贛州市人民醫(yī)院呼吸科，江西 贛州 341000)

0 引言

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等，及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道炎癥機(jī)制在支氣管哮喘的發(fā)病發(fā)展過程中起重要作用，目前認(rèn)為活化的Th2 產(chǎn)生的白介素IL 如IL-4、IL-5 及IL-13 等參與氣道的炎癥過程，同時(shí)IL 等細(xì)胞因子也可直接激活嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等使氣道呈現(xiàn)高反應(yīng)狀態(tài)[1,2]。本研究通過檢測(cè)支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞分型及IL-4 的水平，探討誘導(dǎo)痰技術(shù)對(duì)支氣管哮喘的診斷及分期意義，同時(shí)進(jìn)一步研究IL-4 在支氣管哮喘的慢性炎癥過程中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象分為三組：支氣管哮喘急性發(fā)作組，支氣管哮喘穩(wěn)定組，健康對(duì)照組。哮喘患者均符合2016 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的哮喘防治指南[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，已通過倫理委員會(huì)并簽署知情同意書。急性發(fā)作組為2019 年1 月至2019 年10 月就診于我院呼吸內(nèi)科門診，既往診斷支氣管哮喘，長(zhǎng)期規(guī)律吸入表面激素治療，近期因喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀再次發(fā)生或癥狀加重，需調(diào)整藥物于我院就診的患者，標(biāo)本均在調(diào)整藥物治療前采集；穩(wěn)定組為同期就診于我院門診診斷為支氣管哮喘，長(zhǎng)期規(guī)律吸入表面激素治療，近兩個(gè)月內(nèi)未有急性發(fā)作或全身使用激素的患者；健康對(duì)照組為同期于我院體檢中心體檢，年齡，性別，吸煙史相匹配，胸片，肺通氣功能檢查正常的人員。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究對(duì)象排除慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺疾病、肺結(jié)核等慢性肺部疾病，且無肺心病以外的其他嚴(yán)重心臟病病史，無嚴(yán)重肝、腎疾患及惡性腫瘤病史，無自身免疫性疾病、活動(dòng)性風(fēng)濕疾病、結(jié)締組織病、肝炎、HIV感染等疾病。(2)研究對(duì)象排除不適宜行誘導(dǎo)痰檢查的患者：近期有呼吸道感染、咯血等患者(＜4 周)。(3)研究對(duì)象需排除無法簽署知情同意書及無法配合的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 誘導(dǎo)痰的收集與處理

誘導(dǎo)痰的所有標(biāo)本均采集于調(diào)整藥物之前，并要求患者行口腔清潔。受試者給予吸入沙丁胺醇?xì)忪F劑200μg，15 分鐘之后使用超聲霧化器，將5%的高滲鹽水持續(xù)霧化吸入2 分鐘后，再次進(jìn)行口腔清潔，繼續(xù)霧化10-15 分鐘后鼓勵(lì)患者進(jìn)行深部咳嗽，咳出痰液并收集至少1g 以上。若出現(xiàn)無痰或者痰量不夠的情況，每5 分鐘持續(xù)霧化1 次，總霧化時(shí)間不超過30 分鐘。痰液收集后2h 內(nèi)進(jìn)行處理，挑取粘稠膠凍樣的部分移至15mL無菌離心管中，稱取痰液質(zhì)量后，加入4 倍體積的0.1% 1,4-二硫蘇糖醇(DTT)，在室溫下震蕩30-60 分鐘混勻。37℃水浴箱孵育30 分鐘，300 目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集濾液后進(jìn)行1500rpm/min 的速度離心10 分鐘。上清液收集15mL 無菌離心管中保存至-80℃冰箱留作IL-4 測(cè)定。離心后的細(xì)胞用PBS 重懸吹打。細(xì)胞懸液使用2%臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力，若細(xì)胞存活率＞50%且鱗狀上皮細(xì)胞百分比＜20%則為合格標(biāo)本，可進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.2.2 誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

取離心后細(xì)胞沉淀進(jìn)行痰細(xì)胞涂片，自然風(fēng)干，固定，HE 染色，晾干后用中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類，計(jì)數(shù)400 個(gè)非鱗狀上皮細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，并計(jì)算各種炎癥細(xì)胞所占的百分比。

1.2.3 ELISA 法檢測(cè)誘導(dǎo)痰中IL-4 水平

采用酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA) 測(cè)定誘導(dǎo)痰上清液中IL-4的濃度，操作嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒(美國(guó)RD 公司)說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀檢測(cè)IL-4 水平。

1.2.4 肺功能檢測(cè)于我院肺功能室使用Jaeger 公司的MASTER SCREEN 系列肺功能儀測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

連續(xù)型變量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，兩兩比較方差齊者采用LSD，方差不齊者，采用Welch 校正法，組間兩兩比較采用Dunnett，s T3 法。性別分布采用RxC 資料的卡方檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson(正態(tài)分布資料)或Spearman(非正態(tài)分布資料)相關(guān)。用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

三組患者在年齡、性別分布、肺功能指標(biāo)(FEV1%)上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 入組患者一般情況

2.2 各組誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞百分比

中性粒細(xì)胞在急性發(fā)作組明顯高于穩(wěn)定組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；嗜酸性粒細(xì)胞在急性發(fā)作組明顯高于穩(wěn)定組及對(duì)照組，穩(wěn)定組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；巨噬細(xì)胞在急性發(fā)作組明顯低于穩(wěn)定組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；淋巴細(xì)胞在三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞百分比

2.3 各組誘導(dǎo)痰IL-4 水平

誘導(dǎo)痰中IL-4 水平，急性發(fā)作組與穩(wěn)定組較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；急性發(fā)作組與穩(wěn)定組之間IL-4 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組誘導(dǎo)痰IL-4 水平

2.4 相關(guān)性分析

支氣管哮喘急性發(fā)作組的誘導(dǎo)痰中IL-4 與嗜酸性粒細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.6，P＜0.05)；支氣管哮喘穩(wěn)定組的誘導(dǎo)痰IL-4 與嗜酸性粒細(xì)胞百分比不相關(guān)(r=0.1，P＞0.05)。見圖2。

3 討論

圖2 急性發(fā)作組（左）及穩(wěn)定組（右）IL-4 與嗜酸性細(xì)胞相關(guān)性分析

支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，但氣道慢性炎癥在其中占有重要作用。誘導(dǎo)痰技術(shù)作為鑒別慢性咳嗽病因，越來越受到重視。本研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組，與既往的研究[4]相一致。本研究結(jié)合支氣管哮喘的分期研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在急性發(fā)作組明顯高于對(duì)照組。Demarche 等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞在哮喘患者中的升高可能與不同的支氣管哮喘表型有關(guān)，并且與急性發(fā)作過程中合并的上呼吸道感染相關(guān)，目前尚無統(tǒng)一定論。

IL-4 在支氣管哮喘患者的誘導(dǎo)痰中較對(duì)照組明顯升高。Punia 等[6]及Michaud 等[7]的研究表明，IL-4 與IL-13 在哮喘患者呼吸道炎癥過程及氣道重塑過程中起重要作用，與本研究結(jié)果相符。針對(duì)于IL-4 與哮喘之間的研究多見于循環(huán)系統(tǒng)或支氣管肺泡灌洗液，雖然均提示IL-4 與哮喘的密切關(guān)聯(lián)，但誘導(dǎo)痰中IL-4 研究尚不多見。2012 年一項(xiàng)針對(duì)兒童咳嗽變異性哮喘的研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)痰中IL-4 蛋白及mRNA 的升高，與本研究相一致[8]，提示誘導(dǎo)痰中IL-4 的水平可能對(duì)支氣管哮喘的診斷有重要意義。更有研究針對(duì)Th2 細(xì)胞因子IL-4 的生物治療[1,9]及IL-4 受體的多態(tài)性研究[10]，提示IL-4 作為哮喘發(fā)病的重要機(jī)制，未來可能作為新的有效治療靶點(diǎn)。

而徐友文等[11]的研究證實(shí)，輕中重組哮喘兒童血中的IL-4 明顯高于對(duì)照組，但各組之間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并在布地奈德霧化吸入治療后IL-4 水平明顯下降，與本研究相一致。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者急性發(fā)作組與穩(wěn)定組之間IL-4 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IL-4 在支氣管哮喘的發(fā)病過程起重要作用，但與哮喘的控制情況可能無明顯關(guān)聯(lián)。

支氣管哮喘急性發(fā)作的患者誘導(dǎo)痰IL-4 與嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞與IL-4 在兒童氣道高反應(yīng)性的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用；也有要就發(fā)現(xiàn)哮喘誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞與FENO 呈正相關(guān)[12]，但I(xiàn)L-4 與嗜酸性粒細(xì)胞的研究尚不多見。而王茂[13]等的針對(duì)支氣管哮喘的孕婦的研究發(fā)現(xiàn)，具有支氣管哮喘遺傳背景的新生兒臍血嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)IL-4mRNA 和釋放IL-4 的水平，哮喘組顯著高于對(duì)照組，其釋放的IL-4 在支氣管哮喘發(fā)病中起到重要作用。IL-4 在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要作用毋庸置疑，但針對(duì)IL-4 與嗜酸性粒細(xì)胞的具體關(guān)聯(lián)仍需進(jìn)一步研究。

誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞分型對(duì)支氣管哮喘的診斷與分期有重要意義，對(duì)于臨床鑒別慢性咳嗽的病因有重要作用。IL-4 作為支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的重要部分，可能與激活或者募集嗜酸性粒細(xì)胞，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性相關(guān)。本研究局限于誘導(dǎo)痰中IL-4的研究，未涉及循環(huán)系統(tǒng)中IL-4 的改變及IL-4 與嗜酸性粒細(xì)胞之間的具體關(guān)聯(lián)為本研究的不足，進(jìn)一步的分子實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)探討IL-4 與嗜酸性粒細(xì)胞在支氣管哮喘中的固體機(jī)制。