止嗽立效丸薄層鑒別條件的優(yōu)化及滅菌方式對(duì)薄層鑒別的影響研究

郝津芳

(山西華康藥業(yè)股份有限公司，山西 運(yùn)城 043100)

0 引言

止嗽立效丸品種出自《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊(cè)，由麻黃(制)、苦杏仁(去皮炒)、石膏、甘草、葶藶子、罌粟殼、萊服子七味中藥組成，具有止嗽、定喘、祛痰作用，臨床主要用于風(fēng)寒咳嗽，喘急氣促等癥[1]。藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理中，滅菌過程是必不可少的環(huán)節(jié)，如果所用的滅菌方法不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致藥物的主要成分增加或損失，甚至影響藥物本身的藥理和藥效，使產(chǎn)品不合格。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)保障產(chǎn)品質(zhì)量也至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)2015 版藥典的要求對(duì)止嗽立效丸原標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的鑒別方法加以改進(jìn)，建立鑒別甘草和麻黃兩味藥材的新方法[2-14]。并從薄層色譜圖上定性地比較未滅菌、流通蒸氣滅菌和鈷60 輻照滅菌三種樣本中的主要標(biāo)志成分是否有變化，從而為止嗽立效丸主要藥材成分的定性鑒別及合適滅菌方法的選擇提供參考。

1 儀器與試劑

CBIO-UV6A 多功能暗箱式紫外分析儀，分析天平，HH-S6型電熱恒溫水浴鍋，展開缸，WGL-230B 電熱鼓風(fēng)干燥箱，KQ-250B 型超聲清洗器(工作頻率40KHZ)、隔膜真空泵，硅膠G薄層板(由青島海洋化工有限公司生產(chǎn)和由青島勝海化工有限公司生產(chǎn))，定性濾紙(濾速為中速)，點(diǎn)樣毛細(xì)管(規(guī)格為0.5×100mm)，茚三酮，磷鉬酸，濃氨溶液，鹽酸，甲醇，氯仿，正丁醇，冰醋酸，石油醚(沸點(diǎn)：30℃～60℃)，苯，乙酸乙酯，無水乙醇。

四個(gè)批次的未滅菌、鈷60 輻照滅菌、流通蒸氣滅菌止嗽立效丸細(xì)粉(批號(hào)分別為：Q201712120、Q201712104、Q201712131、Q201712132，均由山西華康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)提供)，甘草對(duì)照藥材、麻黃對(duì)照藥材、甘草次酸對(duì)照品、鹽酸麻黃堿對(duì)照品(均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供)，止嗽立效丸缺甘草陰性樣品、止嗽立效丸缺麻黃陰性樣品(均由山西華康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)提供)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 止嗽立效丸中麻黃藥材薄層鑒別方法的建立

止嗽立效丸的原部版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中建立了麻黃藥材的薄層鑒別方法，但供試品溶液的處理方法步驟多、時(shí)限長(zhǎng)、操作繁瑣，因此本文對(duì)止嗽立效丸中麻黃藥材的鑒別方法進(jìn)行了改進(jìn)且進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

2.1.1 止嗽立效丸中麻黃藥材的薄層鑒別改進(jìn)方法

取本品2 g，加三氯甲烷20 mL，加濃氨試液1 mL，攪拌，加熱回流1 小時(shí)，抽濾。濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸麻黃堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法通則0502 (《中國(guó)藥典》2015 版)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.3%茚三酮正丁醇醋酸溶液(95：5)，在105℃加熱約5 分鐘，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.2 麻黃薄層鑒別改進(jìn)方法的方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.2.1 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

在試驗(yàn)中考察了加熱回流、超聲、冷浸過夜三種供試品溶液的處理方法。均取止嗽立效丸細(xì)粉2 g，加入三氯甲烷20 mL，加濃氨試液1 mL，攪拌，分別加熱回流1 小時(shí)、超聲提取30 分鐘(工作頻率40 KHZ)，放冷，抽濾，濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；另一份冷浸過夜，濾過，濾液用鹽酸溶液(3 →10)調(diào)節(jié)pH 為1，振搖，分取酸水層，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓鳛楣┰嚻啡芤?。以上?.1.1 建立的薄層色譜條件進(jìn)行點(diǎn)樣分析，結(jié)果見圖1。由圖1 可看出：用三種方法制備的供試液，斑點(diǎn)數(shù)相同，其分離鑒別效果相當(dāng)，都能達(dá)到定性鑒別的要求，但原方法用時(shí)長(zhǎng)(冷浸過夜)、步驟多(濾液用鹽酸溶液(3 →10)調(diào)節(jié)pH 為1，振搖，分取酸水層，蒸干)不利于實(shí)際操作，所以選用加熱回流的方法提取或超聲提取，但回流提取條件下，所提取成分的含量較高，因此本試驗(yàn)選擇用加熱回流的方法提取。

圖1 供試品提取方法優(yōu)化圖譜

2.1.2.2 展開溶劑的優(yōu)化

展開劑選擇比例分別為20:5:0.5 和20:4:0.2 的三氯甲烷-甲醇-濃氨試液，結(jié)果見圖 2。由圖2 可以看出，使用展開溶劑三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)可以獲得比三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：4：0.2)更好的分離效果，因此本試驗(yàn)確定以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)為展開劑。

圖2 麻黃展開溶劑的優(yōu)化圖譜

2.1.2.3 最佳點(diǎn)樣量的考察

在實(shí)驗(yàn)中考察了點(diǎn)樣量對(duì)薄層鑒別結(jié)果的影響，分別吸取加熱回流法制備的供試品溶液3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL和對(duì)照品溶液10 μL 點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以上述2.1.1建立的薄層色譜條件進(jìn)行點(diǎn)樣分析，觀察比較顯色劑顯色后不同點(diǎn)樣量的供試品溶液斑點(diǎn)顏色的深淺及大小，結(jié)果見圖3。由圖3 可知：點(diǎn)樣量3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL 均可達(dá)到要求，3 μL、4 μL 點(diǎn)樣時(shí)，斑點(diǎn)顏色較淡，因此本實(shí)驗(yàn)確定的點(diǎn)樣量為5 μL。

圖3 麻黃最佳點(diǎn)樣量考察圖譜

2.1.2.4 最佳展開距離的考察

實(shí)驗(yàn)考察了展距分別為10 厘米、12 厘米、14 厘米時(shí)對(duì)鑒別的影響。觀察并比較在展開距離不同的情況下，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上供試品溶液和對(duì)照藥材溶液的顯色斑點(diǎn)的比移值以及分離效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4 可以看出：展距為10 厘米時(shí)，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上供試品溶液和對(duì)照藥材溶液的顯色斑點(diǎn)有合適的比移值，且與供試品溶液和對(duì)照藥材溶液中其他顯色的斑點(diǎn)展現(xiàn)出較好的分離效果。

圖4 麻黃最佳展開距離考察圖譜

2.1.2.5 陰性干擾試驗(yàn)及陽性試驗(yàn)

取止嗽立效丸缺麻黃陰性樣品2 g，同上述2.1.1 法中供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。取按上述2.1.1 法中制備的供試品溶液0.5 mL 和對(duì)照品溶液0.5 mL，混勻，作為陽性樣品溶液。按照2.1.1 法中確定的薄層色譜條件進(jìn)行點(diǎn)樣分析，觀察并比較在色譜圖中，供試品溶液與陽性樣品溶液在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上的斑點(diǎn)。陰性樣品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上的斑點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 5。由圖5 可知：供試品溶液與陽性樣品溶液色譜圖中，在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無相同顏色的斑點(diǎn)，說明陰性樣品無干擾。陽性樣品溶液色譜圖與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上的斑點(diǎn)顏色比供試品溶液色譜圖與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上的斑點(diǎn)顏色深，排除了陽性干擾。

圖5 麻黃陰性干擾試驗(yàn)及陽性試驗(yàn)考察圖譜

2.1.2.6 耐用性試驗(yàn)

取上述制備好的供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、陽性樣品溶液，在另一生產(chǎn)廠家的薄層G 板(青島勝海)上點(diǎn)樣，按上述方法進(jìn)行分析。結(jié)果見圖6。由圖6 可以看出，供試品在不同廠家硅膠G板的分離效果一致，表現(xiàn)出良好的耐用性。

圖6 麻黃耐用性試驗(yàn)

2.2 止嗽立效丸中甘草藥材薄層鑒別改進(jìn)方法的建立

《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊(cè) “止嗽立效丸”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中也建立了甘草藥材的薄層鑒別方法，但其展開劑中含有毒性試劑-苯，因此本文也對(duì)止嗽立效丸中甘草藥材的鑒別方法進(jìn)行了改進(jìn)且進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

2.2.1 止嗽立效丸中甘草藥材的薄層鑒別方法

取本品1.5 g，加硅藻土1 g，研磨分散，加鹽酸1 mL 與氯仿20 mL，加熱回流1 小時(shí)，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL 使溶解，作為供試品溶液；另取甘草次酸加乙醇制成每1 mL含2 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法通則0502(《中國(guó)藥典》2015 版)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一用硅膠G薄層板上，以石油醚(30-60℃)-甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(10：20：7：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱約5 分鐘，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2.2 甘草薄層鑒別改進(jìn)方法的方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.2.1 展開溶劑的優(yōu)化：甲苯代替苯

吸取上述2.2.1 制備的供試品溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，分別以石油醚(30～60℃)-苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)和石油醚(30～60℃)- 甲苯- 乙酸乙酯- 冰醋酸(5：10：3.5：0.25)為展開劑，觀察比較對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照溶液與3 種滅菌處理方式供試樣品溶液的斑點(diǎn)的顏色及位置關(guān)系。結(jié)果見圖7。由圖7 可以看出，以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)為展開劑時(shí)，所得的薄層圖譜顯示了更好的分離效果，且用兩種展開劑分別展開相同的距離，所得的薄層圖譜上甘草次酸的位置一致，比移值Rf 值基本一致。由于苯毒性較高，可以致癌，可通過皮膚和呼吸道進(jìn)入人體，在人體內(nèi)極其難降解，所以本實(shí)驗(yàn)中將展開劑中的苯用甲苯替代，且替代后仍可獲得較好的分離效果。

圖7 展開溶劑的優(yōu)化

2.2.2.2 最佳點(diǎn)樣量的考察

在實(shí)驗(yàn)中考察了點(diǎn)樣量對(duì)薄層鑒別結(jié)果的影響，分別吸取供試品溶液3 μL、5 μL、8 μL、10 μL、12 μL 和對(duì)照品溶液10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以上述2.2.1 建立的薄層色譜條件進(jìn)行點(diǎn)樣分析，觀察比較顯色劑顯色后在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上不同點(diǎn)樣量的供試品溶液的顏色斑點(diǎn)的顏色深淺及大小。結(jié)果見圖8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5 μL 為最佳點(diǎn)樣量。點(diǎn)樣量為3 μL 時(shí)樣品色斑淺，點(diǎn)樣量為5 μL 時(shí)，樣品色斑剛好看清，所以薄層鑒別方法中選擇5 μL 為最佳點(diǎn)樣量。

圖8 甘草最佳點(diǎn)樣量考察圖譜

2.2.2.3 最佳展開距離的考察

實(shí)驗(yàn)考察了展距分別為13 厘米、15 厘米、17 厘米時(shí)對(duì)鑒別的影響。觀察并比較在展開距離不同的情況下，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上供試品溶液和對(duì)照藥材溶液的顯色斑點(diǎn)的比移值以及分離效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。由圖9 可以看出展開距離為13 厘米時(shí)就可以獲得較好的分離效果，所以薄層鑒別方法中選擇13 厘米為最佳展開距離。

圖9 甘草最佳展開距離考察圖譜

2.2.2.4 陰性干擾試驗(yàn)及陽性試驗(yàn)

取止嗽立效丸缺麻黃陰性樣品2 g，同上述2.2.1 中供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。取按上述2.2.1 法中制備的供試品溶液0.5 mL 和對(duì)照品溶液0.5 mL，混勻，作為陽性樣品溶液。按照2.2.1 法中確定的薄層色譜條件進(jìn)行點(diǎn)樣分析，觀察比較與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上供試品溶液、陽性樣品溶液、陰性樣品溶液的顏色斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 10。由圖10 可以看出供試品溶液與陽性樣品溶液色譜圖中，在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無相同顏色的斑點(diǎn)，說明陰性樣品無干擾。陽性樣品溶液色譜圖與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上的斑點(diǎn)顏色比供試品溶液色譜圖與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上的斑點(diǎn)顏色深，排除了陽性干擾。

2.2.2.5 耐用性試驗(yàn)

取上述制備好的供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液，在另一生產(chǎn)廠家的薄層G 板(青島勝海)上點(diǎn)樣，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。觀察并比較兩種生產(chǎn)廠家的硅膠G 薄層板上薄層色譜圖譜的重現(xiàn)性，評(píng)價(jià)所建立的甘草薄層色譜圖是否對(duì)不同廠家生產(chǎn)的硅膠G 薄層板都具有良好的耐用性。結(jié)果見圖11。由圖11 可以看出實(shí)驗(yàn)中建立的薄層色譜可以在不同廠家生產(chǎn)的薄層板上重現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中建立的甘草薄層色譜方法具有耐用性。

圖10 陰性干擾試驗(yàn)及陽性試驗(yàn)圖譜

2.3 不同滅菌方式對(duì)止嗽立效丸中麻黃、甘草薄層色譜的影響

取3 個(gè)批次(分別為：Q201712104、Q201712131、Q201712132)下經(jīng)過三種不同滅菌方式處理的(未滅菌、60Co 輻照滅菌和流通蒸氣滅菌)止嗽立效丸，按照上述2.1.1 和2.2.1 建立的麻黃及甘草薄層鑒別方法進(jìn)行分析，以考察不同滅菌方式對(duì)止嗽立效丸中麻黃、甘草薄層色譜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下圖12、13。

圖11 耐用性試驗(yàn)圖譜

圖12 不同滅菌方式下麻黃的薄層鑒別

圖13 不同滅菌方式下甘草的薄層鑒別

從圖12、13 中可知：3 個(gè)批次下經(jīng)過三種不同滅菌方式處理的(未滅菌、60Co 輻照滅菌和蒸汽滅菌)止嗽立效丸藥粉制成的供試品溶液薄層色譜圖均顯示，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，即：未滅菌、60Co 輻照滅菌與蒸汽滅菌供試品溶液薄層色譜沒有明顯差異。說明60Co 輻照滅菌與蒸汽滅菌均不會(huì)影響止嗽立效丸的薄層鑒別。

3 結(jié)論與討論

3.1 對(duì)麻黃、甘草薄層色譜原鑒別方法進(jìn)行了改進(jìn)

3.1.1 麻黃鑒別項(xiàng)下供試品溶液的處理方法進(jìn)行了改進(jìn)

原方法為加冷浸過夜，濾過，濾液用鹽酸溶液(3 →10)調(diào)節(jié)pH 為1，振搖，分取酸水層，蒸干，殘?jiān)眉状际谷芙猓鳛樵嚻啡芤?，現(xiàn)改為攪拌，水浴40℃加熱回流1 小時(shí)，放冷，抽濾。濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)省了時(shí)間，降低了成本，增加了穩(wěn)定性。

3.1.2 對(duì)麻黃鑒別項(xiàng)下展開劑的比例進(jìn)行了考察優(yōu)化

將原標(biāo)準(zhǔn)中展開劑三氯甲烷-甲醇-濃氨試液的比例由20：4：0.2 換為20：5：0.5，在20：5：0.5 展開條件下，可獲得比20：4：0.2 更好的分離效果，因此本試驗(yàn)確定以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)為展開劑。

3.1.3 甘草鑒別項(xiàng)下展開溶劑的優(yōu)化

將甘草項(xiàng)下展開劑石油醚(30～60℃)-苯-乙酸乙酯-冰醋酸換為石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)，發(fā)現(xiàn)以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)為展開劑時(shí)，也可滿足薄層鑒別的要求，因此，可考慮將展開劑中的苯換為甲苯，減少實(shí)驗(yàn)的毒性。

3.2 對(duì)改進(jìn)的薄層色譜法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證

對(duì)改進(jìn)的麻黃項(xiàng)和甘草項(xiàng)鑒別方法進(jìn)行了點(diǎn)樣量、展開距離、陰性空白、耐用性等方面考察。試驗(yàn)結(jié)果顯示，改進(jìn)方法可以用于止嗽立效丸中主要藥材麻黃和甘草的鑒別。

3.3 不同滅菌方式薄層色譜的鑒別與比較

采用改進(jìn)的麻黃項(xiàng)和甘草項(xiàng)鑒別方法進(jìn)行了不同批次下不同滅菌方式的麻黃和甘草的薄層色譜圖譜的鑒別與比較，結(jié)果顯示：不同滅菌方式的麻黃和甘草薄層色譜圖譜無明顯差異，說明改進(jìn)的薄層鑒別方法可用于比較不同滅菌方式的止嗽立效丸，且滅菌方式對(duì)止嗽立效丸的薄層鑒別沒有影響。