lncRNA HOTAIR在食管鱗癌患者血清中的表達及其意義

達春麗,劉 凱,孫 偉

達春麗,劉凱,新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院頭頸放射治療科 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市 830000

孫偉,新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外一科 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市 830000

0 引言

食管癌是中國常見的高發(fā)惡性腫瘤之一,其病理類型主要是食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophagus adenous cancer,EAC),其中ESCC占90%以上,大多數(shù)食管鱗癌患者早期臨床癥狀不明顯,在確診時往往已是局部晚期,或伴有淋巴結及遠處轉移,缺乏有效的早期診斷和治療手段,五年生存率不超過30%[1].因此對食管鱗癌的早期或預后預測的研究尤為重要.

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)是一類長度約為200個核苷酸[2],且不表現(xiàn)任何蛋白編碼潛能,以RNA的形式在多種層面(表觀遺傳學、轉錄水平、轉錄后水平)上調控基因表達,在個體發(fā)育及腫瘤發(fā)生、侵襲、轉移及化療抵抗過程中起著重要作用[3,4].HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR)因其在幾乎所有癌癥中均有顯著且一致的上調表達,成為引起研究者們廣泛關注的長鏈非編碼RNA之一[5,6].在生理條件下,lncRNA HOTAIR是人體內重要的反式轉錄調控基因表達的lncRNA,可作用于靶mRNA,抑制HOX的轉錄或翻譯[7],近年來,多項研究指出,lncRNA HOTAIR在口腔癌[8]、結直腸癌[9]、肺癌[10]等多種腫瘤組織中高表達,并與腫瘤的發(fā)展過程密切相關,推測其可作為腫瘤診斷、預后評估的生物標志物和腫瘤治療的靶點.近年來有研究發(fā)現(xiàn),lncRNA HOTAIR不止存在于腫瘤組織,其在乳腺癌[11]和宮頸癌[12]患者血清中表達水平顯著高于健康志愿者,并且發(fā)現(xiàn)伴隨術后體內腫瘤負荷下降,其血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平對癌癥的預測及病情動態(tài)檢測可能具有指導意義.本課題組已有對lncRNA HOTAIR在食管鱗癌組織表達顯著高于其配對癌旁組織的研究結果,其可能在食管鱗癌發(fā)生過程中可能起到重要作用[13],但未對HOTAIR在食管鱗癌血清中表達水平進行研究,本文在前期研究基礎上,對食管鱗癌患者、健康志愿者外周血及食管鱗癌患者組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR的表達差異進行研究對比分析,以期更好地了解lncRNA HOTAIR在食管鱗癌患者診斷中潛在的應用價值,為其作為食管鱗癌臨床診斷分子生物學標志物提供可參考的臨床數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:收集我院胸外科及我科2018-05/2020-03間收治的首診食管鱗癌患者;所有患者無合并其它部位原發(fā)惡性腫瘤或其它嚴重疾病;治療前均完成影像學檢查;提取血液學標本前均未行任何抗腫瘤治療;均經(jīng)手術或內窺鏡取得病理組織,并經(jīng)兩位以上高年資病理教授閱片病理確診為食管鱗癌.

1.1.2 排除標準:排除伴嚴重其它疾病以及合并其他腫瘤者.收集到48例食管鱗癌患者中,男性37例,女性11例;年齡為30-73歲,中位年齡60歲;收集患者臨床病理資料、臨床分期根據(jù)第8版TNM分期,原發(fā)腫瘤分期(T1+T2)10例,(T3+T4)38例,伴區(qū)域淋巴結轉移28例,無淋巴結轉移20例;伴遠處轉移(M)分期8例,無遠處轉移40例;腫瘤發(fā)生部位上段10例,中下段38例;Ⅰ+Ⅱ期10例,Ⅲ期30例,Ⅳ期8例.另外,同時收集來我院見刊體檢的健康志愿者血清標本48例,所有健康志愿者既往體檢,取血前或取血時沒有任何腫瘤病史,也沒有其它已知的嚴重疾病病史.所有參與者外周血標本收集離心后用 1.5 mL離心管收集上清并做好標記,后立即儲存在-80 ℃冰箱備用.組織學標本收集后立即暫存液氮罐后轉入-80 ℃冰箱保存待測.所有參與者(包括所有患者及健康志愿者),均于提取標本前獲知并簽署知情同意書,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過.

1.1.3 試劑與設備:血清RNA提取試劑盒(Qiagen217184),Trizol(美國 Invitrogen),反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 均購自Takara公司,引物由上海生工合成,ABI7500 Fast實時熒光定量PCR儀(美國 Applied Biosystems).

1.2 方法 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血清及組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平.提取血清及組織中總RNA并采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,按照TB Green Ⅱ試劑說明配制反應體系并進行PCR擴增,25 μL反應體系:TB Green Ⅱ (2×) 12.5 μL,cDNA 2.0 μL,正反向引物各1.0 μL,ddH2O 7.0 μL.HOTAIR引物 F:5’-GCCTTTCCCTGCTACTTGTG-3’,R:5’-GGCTGGACCTTTGCTTCTATG-3’;GAPDH引物 F:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,R:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’.PCR反應程序為:預變性95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,共40個循環(huán).lncRNA HOTAIR以GAPDH為內參基因,所得數(shù)據(jù)Ct值采用2－ΔΔCt算法計算HOTAIR的相對表達量.

統(tǒng)計學處理文中所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,因研究數(shù)不符合正態(tài)分布,因此采用M(P25,P75)進行統(tǒng)計學描述,兩樣本間比較采用Mann-WhiteneyU秩和檢驗.兩組間比較也采用Mann-WhiteneyU秩和檢驗;三組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗.血清lncRNA HOTAIR在食管癌患者中的診斷效能以受試者工作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲線描述,相關性采用Spearman相關分析.P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 HOTAIR 在食管鱗癌及健康志愿者血清中表達差異比較:lncRNA HOTAIR食管鱗癌患者血清中相對表達為1.947(0.738-19.892),健康志愿者中為1.15(0.095-9.428),其在食管鱗癌患者中的表達顯著高于健康志愿者,具有統(tǒng)計學意義P=0.0099,圖1.提示血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平升高可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關.

健康志愿者和食管鱗癌患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平受試者工作曲線分析結果:ROC曲線下面積(area under the curves,AUC)為0.8618 (95%CI:0.7831-0.9405,P＜0.01),敏感度為0.7612,特異度為0.9091,其截斷值:14.4670.提示血清lncRNA HOTAIR表達水平對食管鱗癌的診斷敏感度和特異度均較滿意,見圖2.

2.2 食管鱗癌患者血清與其配對癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達相關性 48例食管鱗癌組織lncRNA HOTAIR表達水平[14.94(0.8080,27.22)]與其配對血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平[1.447(0.7328,14.70)]呈正相關,相關系數(shù)rs=0.3920,P=0.0124,見圖3.

圖1 健康志愿者與食管鱗癌患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達比較.

圖2 血清HOTAIR診斷食管鱗癌的受試者工作曲線分析.

2.3 食管癌患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平與臨床病理因素間的關系 伴遠處轉移食管癌患者血清lncRNA HOTAIR表達水平顯著高于無轉移組[20.86(4.44,25.94)vs0.85(0.72,14.00)],差異有統(tǒng)計學意義,P=0.0003;隨TNM分期逐漸變晚,血清lncRNA HOTAIR表達水平[0.83(0.73,12.84)vs1.40(0.68,15.47)vs20.86(4.44,25.94)]逐漸升高,lncRNA HOTAIR表達水平與患者TNM分期顯著正相關,P=0.011.另外發(fā)現(xiàn),HOTAIR表達水平與腫瘤浸潤深度(P=0.0797)、淋巴結轉移(P=0.0671)之間有正相關的趨勢,但尚未見統(tǒng)計學意義.食管鱗癌患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR的表達水平與患者性別、年齡、族別、腫瘤生長部位無顯著相關性,差異無統(tǒng)計學意義,見表1.

3 討論

圖3 食管鱗癌組織與其配對血清中HOTAIR表達水平相關性.

在惡性腫瘤細胞中,某些特定的lncRNA的表達水平會發(fā)生明顯改變,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能通過參與細胞增生、分化、改變細胞侵襲性、轉移性而參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程,進而影響腫瘤患者的病情及后期放化療效果[14,15].

越來越多的證據(jù)表明,lncRNA HOTAIR在多種腫瘤中表達升高,其可能是癌癥發(fā)生、發(fā)展中的一種致癌的驅動因素,并可能成為預測患者對治療反應性及預后的重要生物學指標[13,16,17].劉艷華等[18]通過qRT-PCR對乳腺癌與乳腺良性結節(jié)患者血清lncRNA HOTAIR的對比研究發(fā)現(xiàn),其在癌組織與其外周血中表達水平均顯著高于良性結節(jié)患者,認為lncRNA HOTAIR水平可作為乳腺癌早期診斷的潛在標記物.Wang等人[19]也通過qRTPCR研究食管鱗癌患者與健康志愿者血清中HOTAIR表達水平,發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平顯著高于健康組,且術后1 mo較術前患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR顯著降低,認為血清lncRNA HOTAIR不但可作為癌癥早期診斷的標記物,而且可能成為動態(tài)監(jiān)測病情變化的生物學標志.但是,lncRNA作為循環(huán)腫瘤標志物在食管鱗癌的研究尚處于初級階段.鑒于本課題組前期的研究中已發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達顯著高于配對癌旁組織[13],本研究在以上研究結論基礎上進一步通過qRT-PCR檢測lncRNA HOTAIR在48例健康志愿者與48例食管鱗癌患者血清中表達水平的差異性,分析其作為食管鱗癌診斷早期生物學指標的可能性,研究結果發(fā)現(xiàn),lncRNA HOTAIR在食管鱗癌患者血清中表達水平顯著高于健康志愿者,進一步行ROC曲線下面積分析,結果提示血清lncRNA HOTAIR對食管鱗癌的診斷敏感性和特異性均較滿意,結合既往的文獻我們推測,血清lncRNA HOTAIR有望成為食管鱗癌診斷的早期分子生物學指標.

基于本課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn),食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR不僅有望成為食管鱗癌早期診斷的分子生物學指標,其可能也參與食管鱗癌發(fā)生轉移過程并影響患者不良分期,對102例接受放療食管鱗癌患者組織lncRNA HOTAIR表達情況研究發(fā)現(xiàn),放療有效組食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平顯著低于放療無效組[13],體外實驗進一步研究了不同細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平及其與食管鱗癌細胞放射敏感性關系,結果發(fā)現(xiàn),lncRNA HOTAIR表達水平與細胞放射抵抗性呈顯著正相關[20],然后以其中Eca109細胞為研究對象,比較放射抵抗細胞Eca109R60/2與親本細胞Eca109中HOTAIR表達情況,結果顯示,高表達的HOTAIR可能以時間和劑量依賴的方式參與食管鱗癌細胞的放療抵抗,并可能是食管鱗癌細胞放療敏感性的預測因子[21].本課題在既往研究基礎上,進一步研究lncRNA HOTAIR在患者血清中與其對應癌組織中表達水平的相關性,結果發(fā)現(xiàn),血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平與其對應癌組織表達水平呈顯著正相關,血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達水平與患者臟器轉移狀態(tài)及TNM分期也呈顯著正相關,結合本課題組既往的研究成果,我們推測,動態(tài)監(jiān)測血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR水平可能反映腫瘤負荷的變化,有望可以替代組織活檢,成為一種有效的,微創(chuàng)的生物學指標來動態(tài)判斷患者病情嚴重程度、預測治療效果及預后.

表1 不同臨床特征食管癌患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR相對表達量的比較

4 結論

綜上所述及本研究結果我們推測,血清lncRNA HOTAIR有望成為未來食管鱗癌早期診斷、判斷疾病嚴重程度、預測治療效果及預后的有效生物學指標,外周血腫瘤標記物因其操作方便和微創(chuàng),而表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢,且一直是人們致力研究的方向,因而具有良好的研究價值.限于樣本量有限及研究周期較短,加之患者依從性、醫(yī)療開銷等其他不可控因素未能結合臨床預后的關系進行研究,后續(xù)我們將繼續(xù)加強隨訪人群及隨訪時間管理,擴大樣本量,深入分析血清lnc RNA HOTAIR在食管鱗癌診斷及治療中的應用價值.

文章亮點

實驗背景

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的5年生存率較低,且患者確診時大多已為晚期,尋找有效的生物標志物是早發(fā)現(xiàn)早治療ESCC的有效方法.與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關的LncRNA HOTAIR也與腫瘤的預后有關,lncRNA HOTAIR在ESCC中高表達和可檢測性,可能作為ESCC診斷和預后的潛在分子標志物.

實驗動機

本研究旨在觀察lncRNA HOTAIR 在ESCC患者及健康志愿者血清中的變化差異,分析其在ESCC患者血清及其配對組織和病理分期的相關性,初步探討血清lncRNA HOTAIR作為腫瘤生物標志物在ESCC診斷中的價值.

實驗目標

ESCC患者血清檢測中顯著高于健康志愿者,患者血清lncRNA HOTAIR表達與其配對組織和病理分期具有相關性.

實驗方法

采用RT-qPCR法檢測健康志愿者血清和ESCC患者血清組織中的表達量;采用pearson法分析血清和組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR 表達的相關性,觀察血清lncRNA HOTAIR 表達與病理分期的相關性.

實驗結果

LncRNA HOTAIR在ESCC患者血清中呈高表達,顯著高于健康志愿者;與其配對組織中的表達具有相關性,同時與病理分期具有相關性.

實驗結論

lncRNA HOTAIR有望成為ESCC早期診斷、判斷疾病嚴重程度、預測治療效果及預后的有效生物學指標.

展望前景

LncRNA HOTAIR作為ESCC患者診斷預后標志物仍需要擴大研究樣本量給出截斷值、特異性和靈敏性清晰的定義.