CMTM3在胃癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能研究

李?lèi)?ài)云,吳玉秀,郜娜,張建光,武警特色醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科 天津市300162

孟薇,天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院檢驗(yàn)科 天津市 300300

0 引言

在全球范圍內(nèi),胃癌(gastric cancer,GC)在男性是第3大常見(jiàn)惡性腫瘤,發(fā)病率僅次于肺癌、結(jié)直腸癌占所有腫瘤患者病例數(shù)的7%和死亡人數(shù)的9%[1].2018年,GC新發(fā)103萬(wàn)人,造成78.3萬(wàn)人死亡.20世紀(jì)30年代以前,在世界大部分地區(qū),包括大多數(shù)西方發(fā)達(dá)國(guó)家,GC是最常見(jiàn)的死亡原因[2].然而,近1個(gè)世紀(jì)以來(lái),世界上許多地區(qū)的GC發(fā)病率和死亡率都在下降.其原因可能與食品保鮮方法的改進(jìn)以及食用較少的腌制食品有關(guān).然而目前,GC在東亞尤其是我國(guó)和日本等國(guó)家仍為常見(jiàn)的惡性腫瘤[3-5].

GC整體預(yù)后較差,晚期患者5年生存率低.大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)展遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期或局部晚期,喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)[6].然而,GC發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制仍不完全明晰.近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步及大數(shù)據(jù)分析的不斷發(fā)展,GC研究尤其是相關(guān)信號(hào)通路在其表型中的相關(guān)性取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步.

CMTM為趨化素樣因子家族(CKLFS),是一個(gè)新基因家族[7].CMTM3是趨化素樣因子家族主要成員,在多種人體惡性腫瘤中呈現(xiàn)差異表達(dá),并與細(xì)胞的惡性表型有關(guān).但其上游靶基因及其相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制并不十分清楚.在本研究中,我們采用生物信息分析結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法探討CMTM3基因在GC中的表達(dá)、生物學(xué)功能及其潛在的分子調(diào)控機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和組織標(biāo)本:正常胃上皮細(xì)胞(GES-1)和多個(gè)GC細(xì)胞系(HGC-27,BGC-823和MKN45)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心.選取我院手術(shù)治療的15例GC患者,術(shù)中留取患者癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本后立即置入液氮中迅速冷凍,然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存.組織標(biāo)本獲取經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及家屬知情同意.

1.1.2 儀器與設(shè)備:臺(tái)式低速離心機(jī)(B160A型);熒光定量PCR儀7500HT;超低溫冰箱;無(wú)菌操作臺(tái) Steril CARD Ⅲ Advance;臺(tái)式微型離心機(jī)(Mierofuge18).

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析:在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[8,9]和TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)[10]數(shù)據(jù)庫(kù)中分析CMTM3基因的差異表達(dá)情況.CMTM3差異表達(dá)選取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中2個(gè)芯片數(shù)據(jù)集GSE93415和GSE99415,差異篩選條件為表達(dá)CMTM3表達(dá)上調(diào)或下調(diào)2倍及以上(Log2FC>1),同時(shí)P<0.05.采用microRNA靶基因在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件Targetscan (http://www.targetscan.org/vert_72/)[11],預(yù)測(cè)CMTM3上游靶基因.

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用Trizol試劑(Invitrogen)從細(xì)胞中提取總RNA.分別用PrimeScriPt RT試劑盒和SYBR Prime-ScriPt-RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)和qRT-PCR.miR125b-5P和CMTM3使GAPDH作為內(nèi)參照物.結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算.CMTM3引物序列為:F:5’-TCTTGCGTGTGAATCTCTTACC-3’;R:5’-CAGGATCCACATTGGTGTTACC-3’.

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后,棄去各孔培養(yǎng)基,PBS清洗3次,加入200 μL新鮮完全培養(yǎng)基,并加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,4 h后棄去上清,每孔加入150 μL DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解后,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值,上機(jī)時(shí)設(shè)置調(diào)零孔.以時(shí)間梯度為橫坐標(biāo)(X軸),吸光值為縱坐標(biāo)(Y軸)繪制曲線(xiàn)圖.

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞,取六孔板,將事先處理好的細(xì)胞以50%的細(xì)胞密度均勻鋪與六孔板內(nèi),置于37 ℃5%CO2孵箱中培養(yǎng).24 h后將小干擾至細(xì)胞,并置于37 ℃5%CO2孵箱中培養(yǎng).細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,采用1000 μL槍頭在貼壁細(xì)胞做垂直的劃痕,然后棄掉培養(yǎng)基并用1×PBS清洗2遍后加入培養(yǎng)基后置于37 ℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng).分別在上述細(xì)胞劃痕后0、24、48 h后采用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞遷移情況,并隨機(jī)記錄3個(gè)視野下的細(xì)胞遷移距離.

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)GC MKN45細(xì)胞,將構(gòu)建的miR-125b-5P mimics與PmiR-GLO-CMTM3-3’UTR共轉(zhuǎn)染至MKN45細(xì)胞中,CMTM3基因的3’UTR區(qū)克隆至載體腎熒光素酶基因下游位點(diǎn).構(gòu)建結(jié)合miR-125b-5P mimics與對(duì)照的野生型(WT)報(bào)告質(zhì)粒及突變型(MUT)報(bào)告質(zhì)粒.采用LiPofectamine 3000試劑盒說(shuō)明,轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的質(zhì)粒至MKN45細(xì)胞.轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè).

圖1 CMTM3基因在多種腫瘤及胃癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系.A:CMTM3在人體多種實(shí)體腫瘤中的表達(dá)情況(數(shù)據(jù)來(lái)源TCGA數(shù)據(jù)庫(kù));B:CMTM3在胃癌患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,數(shù)據(jù)來(lái)源TCGA數(shù)據(jù)庫(kù).T:癌組織.N:癌旁正常組織;C:隨著胃癌分期的增高,CMTM3表達(dá)水平增高;D:CMTM3高表達(dá)患者總生存降低;E:CMTM3高表達(dá)患者無(wú)疾病進(jìn)展生存降低;F:免疫組化顯示胃癌組織中CMTM3高表達(dá);G:正常胃組織中CMTM3低表達(dá).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析采用R軟件完成,計(jì)量資料用mean±SD表示,組間比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用相對(duì)數(shù)表示,行χ2檢驗(yàn),雙側(cè)P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

圖2 下調(diào)CMTM3表達(dá)后胃癌細(xì)胞的遷移和增殖能力減低.A:不同胃癌細(xì)胞系中CMTM3表達(dá)水平比較;B:針對(duì)CMTM3基因序列,合成3個(gè)針對(duì)CMTM3的小干擾RNA,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后判斷其下調(diào)CMTM3基因mRNA表達(dá)情況;C:sh-CMTM3-1下調(diào)MKN45細(xì)胞系中CMTM3表達(dá)后,細(xì)胞遷移能力減低;D:sh-CMTM3-1下調(diào)MKN45細(xì)胞系中CMTM3表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力減低.

2.1 CMTM3基因表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中,CMTM3基因mRNA在多種腫瘤及GC中的表達(dá)明顯上調(diào)(圖1A);在GC患者,癌組織中的CMTM3基因mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃組織(圖1B).同時(shí),隨著GC患者分期的升高,CMTM3基因表達(dá)水平也增加(圖1C).預(yù)后分析數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),高低表達(dá)組患者各192例,隨訪(fǎng)時(shí)間130 mo,根據(jù)CMTM3基因mRNA表達(dá)水平分為高和低表達(dá)組(CMTM3表達(dá)水平≥中位數(shù)為高表達(dá),反之為低表達(dá)),CMTM3基因高表達(dá)GC患者OS和DFS均低于低表達(dá)患者(圖1D,E).免疫組化顯示,CMTM3基因編碼蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,在癌組織中高表達(dá)而在正常胃組織中低表達(dá)(圖1F,G)

2.2CMTM3基因生物學(xué)功能CMTM3基因mRNA在不同GC細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于正常胃上皮細(xì)胞(GES-1),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),MKN45GC細(xì)胞中CMTM3基因標(biāo)的水平最高,圖2A.外源性小干擾RNA(sh-CMTM3-1)可顯著下調(diào)MKN45GC細(xì)胞中CMTM3基因表達(dá)(P<0.05),圖2B.sh-CMTM3-1下調(diào)MKN45GC細(xì)胞中CMTM3基因表達(dá)后,細(xì)胞的遷移能力明顯減低(P<0.05),圖2C.MTT實(shí)驗(yàn)顯示,sh-CMTM3-1下調(diào)CMTM3表達(dá)后,MKN45GC細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05),圖2D.

2.3 CMTM3上游靶基因預(yù)測(cè) GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GCvs正常胃黏膜差異表達(dá)芯片GSE93415和GSE99415,篩選出差異表達(dá)micro12個(gè)(圖3A,B).同時(shí)采用miRNA靶基因下線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件,篩選出與上述12個(gè)差異表達(dá)基因重合的microRNA 3個(gè),分別為miR-375,miR-125b-5P和miR-135b-5P(圖3C,D).其中miR-125b-5P下調(diào)CMTM3基因在GC細(xì)胞中的表達(dá)最為明顯(P<0.05)(圖3E).

2.4 miR-125b-5P和CMTM3表達(dá)相關(guān)性 miR-125b-5P在正常胃粘膜細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯高于GC細(xì)胞系(P<0.05),圖4A.GC患者癌組織中miR-125b-5P表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05),圖4B.CMTM3基因在GC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05),圖4C.GC組織中CMTM3與miR-125b-5P表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rPearson=-0.58,P<0.05).MKN45細(xì)胞中,miR-125b-5P可顯著下調(diào)CMTM3基因表達(dá)(P<0.05),圖4E.熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)顯示miR-125b-5P基因與CMTM3基因3’UTR靶向結(jié)合,圖4F.

2.5 miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達(dá)抑制GC細(xì)胞增殖和遷移 在GCMKN45細(xì)胞中,miR-125b-5P可顯著下調(diào)CMTM3表達(dá)(P<0.05),圖5A.MTT實(shí)驗(yàn),下調(diào)CMTM3表達(dá)后GCMKN45細(xì)胞增殖能力明顯減低(P<0.05),圖5B.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達(dá)后GCMKN45細(xì)胞遷移能力也明顯下降(P<0.05),圖5C.

3 討論

圖3 CMTM3上游靶基因預(yù)測(cè).A:GSE93415胃癌差異表達(dá)microRNA火山圖;B:GSE99415胃癌差異表達(dá)microRNA火山圖;C:GSE93415、GSE99415數(shù)據(jù)集和Targetscan預(yù)測(cè)CMTM3上游靶基因的Venn圖;D:篩選出的3個(gè)共差異表達(dá)micrRNA,分別為miR-375,miR-125b-5P和miR-135b-5P;E:miR-125b-5P下調(diào)CMTM3基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)最為顯著.

GC是臨床上最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,也是癌癥相關(guān)死亡的重要原因,在所有癌癥死亡原因中排第三位置[12].盡管患者接受了外科手術(shù)或放化療,GC患者的預(yù)后仍不理想,晚期患者遠(yuǎn)期生存率極低.晚期GC患者化療及放療效果十分有限,大多數(shù)患者僅能從放化療中獲益很少,其主要原因?yàn)槠淠[瘤細(xì)胞增殖、侵襲的分子機(jī)制未能完全明晰[4,13,14].因此,這里迫切需要更好地了解GC發(fā)生發(fā)展及增殖等生物學(xué)功能的分子機(jī)制及其相關(guān)信號(hào)通路.

CMTM3是趨化素樣因子家族主要成員,在多種人體惡性腫瘤中呈現(xiàn)差異表達(dá),并與細(xì)胞的惡性表型有關(guān)[15,16].已有研究顯示CMTM家族蛋白在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[17,18].依據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道,CMTM不同家族成員在不同的腫瘤中的生物學(xué)功能并不完全相同,甚至在不同的腫瘤中呈現(xiàn)出相反的生物學(xué)功能[19].有文獻(xiàn)報(bào)道,CMTM3在前列腺癌中表達(dá)水平較低,進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞CMTM3表達(dá)水平后,其增長(zhǎng)和侵襲能力增強(qiáng),提示CMTM3在前列腺癌中可能發(fā)揮了抑癌基因的作用[20].然而在本研究中,我們通過(guò)生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),CMTM3基因mRNA在大多數(shù)人體腫瘤組織中表達(dá)水平是上調(diào)的,提示其在人實(shí)體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用.我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了針對(duì)CMTM3的外源性小干擾RNA,轉(zhuǎn)讓GC細(xì)胞MKN45后,細(xì)胞的增殖和遷移能力減低,提示CMTM3在GC的增殖和遷移生物學(xué)功能方面具有重要作用.進(jìn)一步我們對(duì)相關(guān)GC差異表達(dá)micorRNA基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析,并結(jié)合microRNA靶基因在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件證實(shí)了miR-125b-5P為CMTM3上游重要的靶基因,并能夠下調(diào)CMTM3在GC細(xì)胞中的表達(dá),并抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力.

圖4 胃癌細(xì)胞系及胃癌組織、正常胃組織中CMTM3、miR-125b-5P相對(duì)表達(dá)水平及相關(guān)性.A:miR-125b-5P在各胃癌細(xì)胞系中的表達(dá);B:miR-125b-5P在胃癌和正常胃組織中的表達(dá);C:CMTM3胃癌和正常胃組織中的表達(dá);D:miR-125b-5P和CMTM3在胃癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān);E:miR-125b-5P可顯著下調(diào)MKN45胃癌細(xì)胞中CMTM3表達(dá)水平;F:熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)顯示miR-125b-5P基因與CMTM3基因3’UTR靶向結(jié)合.

圖5 miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移.A:miR-125b-5P可顯著下調(diào)MKN45細(xì)胞中CMTM3表達(dá);B:MTT實(shí)驗(yàn)下調(diào)CMTM3表達(dá)后胃癌MKN45細(xì)胞增殖能力明顯減低;C:劃痕實(shí)驗(yàn)顯示miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達(dá)后胃癌MKN45細(xì)胞遷移能力明顯下降.

CMTM3基因在GC組織及GC細(xì)胞株中高表達(dá),并與GC患者的預(yù)后有關(guān).時(shí)miR-125b-5P可靶向抑制CMTM3的表達(dá),并影響MKN45 GC細(xì)胞的增殖和遷移.miR-125b-5P和CMTM3相關(guān)信號(hào)通路望成為GC預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn).然而,CMTM3在不同腫瘤中的高低表達(dá)有差異,其大多數(shù)情況下作為抑癌基因發(fā)揮作用并在腫瘤組織中低表達(dá).但CMTM3在不同腫瘤中也呈現(xiàn)高表達(dá),可能作為癌基因發(fā)揮.因此,其確切分子機(jī)制并不完全清楚,在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用.我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù),顯示期在GC中均為高表達(dá).但由于CMTM3不同腫瘤組織中的表達(dá)水平存在差異,該基因在其他腫瘤中的作用及生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

miR-125b-5P靶向調(diào)控CMTM3基因表達(dá)影響GC增殖和遷移能力,并有望成為GC預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌(gastric cancer,GC)是臨床常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤,然而其發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制仍不完全明晰.CMTM3是趨化素樣因子家族主要成員,在多種人體惡性腫瘤中呈現(xiàn)差異表達(dá),并與細(xì)胞的惡性表型有關(guān).但其上游靶基因及其相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制并不十分清楚.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究目的在于采用生物信息分析結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法探討CMTM3基因在GC中的表達(dá)、生物學(xué)功能及其潛在的分子調(diào)控機(jī)制,為后續(xù)靶向藥物的研發(fā)提供新的潛在靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探尋CMTM3基因在GC細(xì)胞系及組織中的表達(dá)、及其對(duì)GC細(xì)胞增殖、遷移和穿膜能力的影響,同時(shí)探討其潛在的分子調(diào)控機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

生物信息法分析CMTM3基因的差異表達(dá)情況,并比較CMTM3基因在上皮細(xì)胞和多個(gè)GC細(xì)胞系中表達(dá)情況.在GC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染外源性小干擾下調(diào)細(xì)胞中CMTM3基因表達(dá)后評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖和遷移能力.預(yù)測(cè)CMTM3上游靶基因,雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-125b-5P與CMTM3靶向調(diào)控關(guān)系.轉(zhuǎn)染外源性miR-125b-5P-mimic,評(píng)價(jià)GC細(xì)胞增殖和遷移能力的變化.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

GC組織中的CMTM3基因mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃組織(P<0.05),并于預(yù)后有關(guān).miR-125b-5p可顯著下調(diào)GC細(xì)胞CMTM3表達(dá),并影響細(xì)胞的增殖和遷移能力(P<0.05).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

miR-125b-5p靶向調(diào)控CMTM3基因表達(dá)影響GC增殖和遷移能力,并有望成為GC預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn).

展望前景

miR-125b-5p靶向抑制CMTM3基因的表達(dá),并影響GC患者的預(yù)后,有望成為GC靶向藥物開(kāi)發(fā)的新靶點(diǎn)及信號(hào)通路.