建佛手總黃酮的超聲波提取工藝優(yōu)化及抗氧化分析

黃 靖，陳 嬋，黃曉梅

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，福州350007）

0 引言

佛手為蕓香料柑桔屬植物，是傳統(tǒng)的名貴中藥，也是首批藥食同源植物[1]。佛手全身都是寶，其藥性溫，味辛、苦、酸，歸肝、脾、肺經(jīng)?，F(xiàn)代研究表明，佛手富含黃酮、多糖、揮發(fā)油、檸檬油素和香豆素等多種活性成分[2-5]。黃酮類化合物作為佛手的主要藥效成分，有解痙、降血糖、降血脂、抗菌消炎、抗氧化等多種藥理活性[6-8]。

佛手在中國長江以南各地均有栽種，按照產(chǎn)地可分為廣佛手、川佛手、金佛手和建佛手[9]。佛手總黃酮的提取研究涉及廣東、廣西的廣佛手、浙江的金佛手以及四川的川佛手的較多[10-15]。鄧祥等[10-11]研究了川佛手中黃酮類物質的微波和超聲波聯(lián)合提取工藝及超臨界CO2流體萃取技術，在最佳提取工藝條件下，川佛手總黃酮的提取率分別約為44.05 mg/g和3.79%。章斌等[12-13]研究了復合酶法和超聲提取廣佛手總黃酮的工藝，佛手總黃酮得率分別為4.093%和3.22%。王晉等[14]進行了廣佛手中黃酮提取工藝的優(yōu)化，黃酮得率為1.34%。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、不同的提取方法對佛手黃酮提取影響較大[15-17]。目前，有關建佛手中黃酮提取研究較少。

超聲波設備已經(jīng)運用得越來越廣泛，超聲波產(chǎn)生的空化作用和機械作用等能有效提高細胞破碎效率，有利于有效成分的析出，操作簡單，且對設備要求不高，提取率高，反應過程無物料損失，回收率相對較高[18]。筆者采用超聲波提取技術，以建佛手為原料，研究超聲波提取法提取總黃酮的最優(yōu)工藝，并對提取得到的佛手總黃酮進行抗氧化研究，以期為福建本地佛手資源的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手是由福建省賢芳佛手農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供的建佛手[19]。

蘆丁標準品（Aladdin Chemistry Co.Ltd.，蕓香葉苷，分析標準品，≥98%）。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚等所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PB 80 Easy 218美的破壁機（廣東美的生活電器制造有限公司），101-2型鼓風干燥箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司），RE-52B型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），KQ-300VDV三頻數(shù)控超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司），722S可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取建佛手總黃酮

工藝流程：清洗→切片→烘干→粉碎→過篩→脫脂、脫色→浸泡佛手粉→超聲提取→抽濾→定容→測定吸光值。

操作要點：（1）原料預處理。福建佛手清洗切片后，50℃干燥至恒重，粉碎成一定粒度，過40目篩，備用。（2）脫脂。用石油醚浸泡一定時間去色，重復3次，余下的固體粉末自然揮發(fā)干，備用[20]。（3）超聲提取。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)在其他條件固定的情況下，采用超聲頻率為45 kHz/80 kHz雙頻模式時，即每隔30 s轉換一次的超聲條件下，佛手總黃酮的提取率最高，因此均采用雙頻模式，以一定量佛手干粉按照料液比用一定濃度的乙醇溶液先浸泡30 min后，分別用不同的超聲功率提取不同時間。（4）樣品測定。超聲提取結束后，抽濾，上清液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇。濾液用相同濃度的乙醇溶液定容至100 mL，稀釋至一定濃度，測定樣品液中總黃酮含量。

1.3.2 標準曲線的繪制及樣品測定計算 準確配制濃度為1.0 mg/mL蘆丁標準液，吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蘆丁溶液于10 mL具塞刻度試管中，先加0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻并放置6 min后，加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6min，最后加入4.0mL NaOH(1 mol/mL)溶液，用60%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置15 min后于510 nm下測定吸光度x，得到蘆丁質量濃度y(mg/mL)與吸光度x之間的線形回歸方程[13]。在0～0.12 mg/mL的線性范圍內，線性方程為y=1.1243x+0.0045，R2=0.9998。

樣品測定：將提取的樣品液稀釋至一定濃度，吸取1.0 mL按上述步驟操作，根據(jù)標準曲線方程計算出提取液中總黃酮的含量，并以此計算各處理的總黃酮提取率[式(1)]。

式中，C為提取液中的總黃酮濃度，V為提取液的體積，M為建佛手的質量。

1.3.3 單因素實驗及正交實驗 參考文獻[10-14]，單因素實驗設計以建佛手干粉為試樣，總黃酮得率為考察指標，分別考察料液比、乙醇濃度、超聲提取時間、超聲溫度以及超聲功率5個因素對佛手總黃酮得率的影響。采用45 kHz/80 kHz雙頻模式，固定超聲功率50W，提取溫度50℃，提取時間60 min，乙醇濃度60%，料液比1:15、1:20、1:25、1:30、1:35；固定料液比 1:30，提取溫度50℃，超聲功率50 W，提取時間60 min，乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%；固定超聲時間60 min，料液比1:30，乙醇濃度60%，提取溫度50℃，超聲功率50、60、70、80 W；固定料液比1:30，超聲功率50 W，提取溫度50℃，乙醇濃度60%，浸提時間40、60、80、100、120 min；固定料液比1:30，超聲功率50 W，乙醇濃度60%，浸提時間 60 min，浸提溫度為 40、50、60、70、80℃。

根據(jù)單因素實驗最終結果選定4因素3水平進行正交實驗，確定超聲波提取的最佳工藝參數(shù)。

1.3.4 驗證實驗及精密度實驗 準確稱取5份佛手試樣，以正交實驗得出的最佳提取工藝進行5次平行實驗，分別按照1.3.2中的方法進行總黃酮含量的測定[21]。

以正交實驗得出的最佳提取工藝進行5次平行實驗，然后分別準確量取2.00 mL待測液于5個10 mL比色管中，分別按照1.3.2的方法進行總黃酮含量的測定。

1.3.5 加標回收率 準確移取已知總黃酮質量濃度的建佛手溶液0.5 mL，平行5份，分別置于25 mL比色管中，再分別準確加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的蘆丁標準溶液(0.2 mg/mL)。按1.3.2方法測定總黃酮質量濃度[22]。

1.3.6 建佛手總黃酮的抗氧化研究 比較同濃度下建佛手總黃酮與Vc對羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。采用Fenton反應法測定佛手總黃酮清除·OH能力[23-24]，采用鄰苯三酚自氧化法測定佛手總黃酮清除O2-·能力[25-26]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 單因素及正交實驗均平行3次，應用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 料液比對建佛手總黃酮提取率的影響

圖1結果顯示，料液比影響建佛手總黃酮的提取率。在料液比為1:15～1:30范圍內，佛手總黃酮得率呈上升趨勢，當料液比為1:30時，建佛手總黃酮的提取率最高，達到2.22%。

圖1 料液比對建佛手總黃酮提取率的影響

2.2 乙醇濃度對建佛手總黃酮提取率的影響

圖2結果表明，乙醇濃度在40%～60%范圍內，佛手總黃酮與乙醇濃度呈正相關。乙醇濃度為60%時，提取率最高，達到2.32%，隨著乙醇濃度的提高，提取率反而下降。

圖2 乙醇濃度對佛手總黃酮提取率的影響

2.3 超聲功率對建佛手總黃酮提取率的影響

圖3結果表明，超聲功率對建佛手總黃酮的提取率有影響，超聲功率為50 W時，建佛手總黃酮的提取率最高，為2.81%。當超聲功率超過50 W范圍，超聲功率越高，總黃酮的提取反而下降。

圖3 超聲功率對佛手總黃酮提取率的影響

2.4 超聲提取時間對建佛手總黃酮提取率的影響

圖4結果表明，在雙頻率、超聲功率50 W、提取溫度50℃、料液比1:30的提取條件下，超聲時間在60 min時，建佛手總黃酮的提取率最高，隨之下降。原因可能在于當超聲時間過長易造成總黃酮的降解，而使提取率下降。

圖4 超聲時間對佛手總黃酮提取率的影響

2.5 提取溫度對建佛手總黃酮提取率的影響

在超聲過程中，無論采用哪種頻率模式，都會造成溫度的小幅波動。在雙頻模式下，溫度的波動幅度在1～3℃。圖5結果表明，當溫度超過50℃時，超聲提取溫度越高，總黃酮的提取率反而下降，在其他因素確定的條件下，溫度對總黃酮提取率的影響不太顯著，故提取溫度不作為正交實驗考慮因素。

圖5 超聲溫度對佛手總黃酮提取率的影響

2.6 正交實驗結果分析

根據(jù)單因素實驗結果，得出因素水平（表1）。以建佛手干粉為試樣，以總黃酮提取率為考察對象，選擇料液比、乙醇濃度、超聲功率、超聲提取時間4種因素，進行L9(34)進行正交實驗，研究超聲波提取佛手總黃酮的最佳提取條件。結果分析見表2～3。

表1 因素水平表

表2 建佛手總黃酮超聲波提取的正交實驗結果

在影響建佛手總黃酮的超聲波提取工藝中，影響因素為C（超聲功率）＞D（提取時間）＞B（乙醇濃度）＞A（料液比）。超聲功率對佛手總黃酮的提取率影響極顯著(P＜0.01)，超聲時間與乙醇濃度的影響顯著(P＜0.05)，料液比影響無顯著性。根據(jù)正交實驗結果，超聲波提取建佛手總黃酮最佳提取工藝條件為A3B2C1D3，即料液比1:35、乙醇濃度60%、超聲功率50 W、提取溫度50℃條件下提取80 min，建佛手總黃酮的提取率最高。

2.7 驗證實驗及精密度

按照正交實驗選定的A3B2C1D3進行5次平行實驗，取平均值，得到此條件下的提取率為3.33%，RSD值為0.62%，驗證實驗結果與正交實驗結果一致。表明超聲波輔助提取建佛手總黃酮工藝可靠，相對標準偏差小，工藝穩(wěn)定可行。

2.8 加標回收率

根據(jù)1.3.5的方法，測定加標回收率，平均回收率為96.34%，RSD=0.83%(n=5)，說明該方法準確度高、實驗結果可靠，此工藝條件下提取建佛手總黃酮是可行的。

2.9 建佛手總黃酮抗氧化活性分析

配制0.2～1.4 mg/mL質量濃度的建佛手總黃酮提取液，以相同濃度的Vc溶液為對照組。用Fenton反應法及鄰苯三酚自氧化法測定2種溶液對·OH及對O2-·的清除作用，結果見圖6～7。結果顯示，建佛手總黃酮溶液具有抗氧化活性，濃度0.2～1.4 mg/mL清除能力與濃度呈正比，然而對·OH及對O2-·的清除作用均不如同濃度的Vc溶液。當建佛手總黃酮質量濃度為1.4 mg/mL時，佛手總黃酮對·OH和O2-·的清除率分別為54.4%和39.2%。

圖6 建佛手總黃酮與Vc對O2-·的清除能力

圖7 建佛手總黃酮與Vc對·OH的清除能力

3 結論

本研究通過超聲波提取技術，獲得建佛手總黃酮的最優(yōu)提取工藝，即超聲頻率為45 kHz與80 kHz雙頻模式下，料液比1:35，乙醇濃度60%，超聲功率50 W，提取溫度50℃，提取80 min，建佛手總黃酮的提取率最高，可達3.33%。與其他產(chǎn)地的佛手總黃酮含量相比，建佛手總黃酮含量低于川佛手，高于廣佛手[10-15]。

表3 實驗結果方差分析表

體外抗氧化活性實驗表明，建佛手總黃酮溶液具有抗氧化活性，濃度0.2～1.4 mg/mL其清除能力與濃度呈正比，然而對·OH及對O2-·的清除作用均不如同濃度的Vc溶液。當建佛手總黃酮質量濃度為1.4 mg/mL時，佛手總黃酮對·OH和O2-·的清除率分別為54.4%和39.2%。

4 討論

在同樣采用超聲波輔助提取總黃酮的技術中，本研究結果與其他產(chǎn)地的佛手總黃酮提取率較接近，然而提取時間縮短，原因可能在于采用了雙頻模式。在超聲波輔助提取工藝中，不同頻率的超聲波對總黃酮的提取率有影響，超聲頻率是決定超聲作用的重要因素，高頻超聲不易發(fā)生空穴作用，且方向性強，散射強，超聲頻率對超聲浸取效果的影響復雜[27]，故多數(shù)提取工藝固定某種頻率[28-29]，本研究實驗表明，采用雙頻模式，有利于提高總黃酮提取率，并縮短提取時間，超聲頻率及超聲功率對佛手總黃酮提取的影響及動力學模型可進一步研究。建佛手體外抗氧化活性實驗為開發(fā)新型的佛手黃酮保健品提供了理論依據(jù)。