抗獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病蠟樣芽孢桿菌MA23培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

朱海云，馬 瑜，柯 楊，李 勃

（陜西省微生物研究所，西安710043）

0 引言

隨著人口的不斷增長(zhǎng)及可利用土地資源的持續(xù)減少，人類對(duì)食品的需求日益增加，而農(nóng)作物病害的不斷發(fā)生嚴(yán)重威脅著全球食品安全[1]。多年來(lái)，化學(xué)藥劑因高效、低成本等特點(diǎn)成為防治農(nóng)作物病害的主要藥劑，但隨之而來(lái)的一系列負(fù)面效應(yīng)，如環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)以及病原菌抗藥性等問(wèn)題，已經(jīng)引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注。因此，尋找新的綠色、無(wú)公害防治藥劑成為提升農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。其中，利用微生物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物防治，被公認(rèn)為是一種環(huán)境友好型的選擇。

微生物類生防菌在防治多種植物病害的同時(shí)可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，且有助于改善種植環(huán)境，從而獲得長(zhǎng)期效益。目前，已有許多生防菌被商業(yè)化生產(chǎn)，如芽孢桿菌、假單胞菌等[2]。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一類能產(chǎn)生抗逆性芽孢的革蘭氏陽(yáng)性好氧菌，它對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，抗逆性強(qiáng)，繁殖速度快，能適應(yīng)各種環(huán)境，廣泛存在于自然界中[3]。蠟樣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抗生素、細(xì)菌素、抗菌肽等多種具有抑菌活性的物質(zhì)[4-6]，可有效抑制多種植物病原菌，如番茄腐爛病病原菌(Pythium aphanidermatum)、番茄青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)、玉米穗腐病病原菌(Fusarium verticillioides)、小麥紋枯病病原菌(Rhizoctonia cerealis)、Pseudomonassyringae和Agrobacteriumtumefaciens等[7-11]。Goutam Banerjee等將蠟樣芽孢桿菌IB311應(yīng)用于花生和芝麻田間實(shí)驗(yàn)，證明其可以有效提高作物產(chǎn)量[12-13]。

目前，已有大量蠟樣芽孢桿菌抑制植物病原菌的報(bào)道，而將其應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的報(bào)道還較為少見(jiàn)[14]。生防菌能否走向?qū)嶋H應(yīng)用受到多種因素的影響，而發(fā)酵是首要的影響環(huán)節(jié)。提高發(fā)酵液的菌體量及抑菌活性將為進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。菌體量及抑菌活性的提高是保證其定殖能力、穩(wěn)定性以及防治效果的關(guān)鍵[15-16]，而培養(yǎng)基配方對(duì)菌體量及抑菌活性具有顯著的影響，因此，優(yōu)化培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)發(fā)酵中提高菌體量及抑菌活性的一個(gè)重要步驟[17]。此外，發(fā)酵條件對(duì)于發(fā)酵液中的菌體量以及代謝產(chǎn)物活性也至關(guān)重要。因此，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件可以有效提高發(fā)酵液的菌體量和抑菌活性[18-19]。

獼猴桃潰瘍病是一種由革蘭氏陰性菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa)引起的嚴(yán)重病害，該病于20世紀(jì)80年代在日本首次發(fā)病，之后迅速席卷世界各大獼猴桃產(chǎn)區(qū)[20]。獼猴桃潰瘍病主要危害樹(shù)干、枝條，嚴(yán)重時(shí)造成植株、枝干枯死，同時(shí)危害葉片和花蕾，導(dǎo)致果皮變厚，果實(shí)畸形，產(chǎn)量降低[21]。獼猴桃潰瘍病傳染性強(qiáng)，根除難度大，目前還沒(méi)有有效的防治藥劑。傳統(tǒng)的防治藥劑主要是銅制劑和農(nóng)用鏈霉素。由于病原菌變異性強(qiáng)，極易產(chǎn)生抗藥性，已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)銅制劑和農(nóng)用鏈霉素的抗藥性菌株[22-24]。因此，應(yīng)用安全、可靠、無(wú)殘留、對(duì)環(huán)境友好的生防菌進(jìn)行獼猴桃潰瘍病的防治已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。本研究在前期分離得到一株對(duì)Psa抑制效果顯著的蠟樣芽孢桿菌MA23的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)蠟樣芽孢桿菌MA23的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為該菌株的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)于2019年8月至2020年1月在陜西省微生物研究所微生物技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展。蠟樣芽孢桿菌MA23從秦嶺野生銀杏樹(shù)組織中分離獲得，保藏于陜西省微生物研究所菌種保藏中心(SMRL)。獼猴桃潰瘍病病原菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringaepv.actinidiae)由本課題組分離并保藏于陜西省微生物研究所菌種保藏中心(SMRL)。

PSA培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，蔗糖2%，K2HPO40.05%，MgSO4?7H2O 0.025%，瓊脂15%，余量為水，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉0.5%，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉，余量為水，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基[25]：葡萄糖2.5%，蛋白胨0.05%，可溶性淀粉4%，NaNO30.3%，MgSO40.15%，K2HPO40.25%，CaCO30.12%，MnSO40.035%，余量為水，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 菌體培養(yǎng)

1.2.1 菌種活化 將-80℃保存的菌種劃線接入LB斜面，30℃靜置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于斜面于30℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.2 種子液制備 取一環(huán)活化后的斜面菌種到裝有50 mL液體LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)16 h。

1.2.3 初始及正交發(fā)酵培養(yǎng) 以5%的接種量將種子液接種于裝有70 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

1.3 發(fā)酵液活菌數(shù)測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)發(fā)酵液中的活菌數(shù)[26]。

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化

以葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、可溶性淀粉(C)、NaNO3(D)、K2HPO4(E)和 MgSO4(F)為考察因素，以發(fā)酵液中的活菌數(shù)為菌體量指標(biāo)，運(yùn)用SPSS 20軟件設(shè)計(jì)混合正交實(shí)驗(yàn)，其中葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉和NaNO3各安排4個(gè)水平，K2HPO4和MgSO4各安排2個(gè)水平。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別平行取樣。

以正交優(yōu)化后的最優(yōu)培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)依次對(duì)發(fā)酵條件（初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量及轉(zhuǎn)速）進(jìn)行優(yōu)化，分析其對(duì)菌體量的影響，確定最佳發(fā)酵條件。

1.5 發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

以Psa作為指標(biāo)菌，采用管碟法[27]測(cè)定菌株MA23發(fā)酵液的抑菌活性。取100 mL PSA培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃，向其中加入1 mL濃度為108CFU/mL的Psa菌懸液，混勻，倒平板；同時(shí)，以無(wú)菌水為對(duì)照。每個(gè)平板上均勻放置3個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯加入200 μL發(fā)酵液，28℃下培養(yǎng)48 h，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次平行，取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2007進(jìn)行各因素各水平的K值計(jì)算及發(fā)酵條件優(yōu)化數(shù)據(jù)的處理和作圖。應(yīng)用SPSS 20進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)方差分析[28-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及Kij值如表1所示，方差分析結(jié)果如表2所示。由方差分析結(jié)果可知，因素B、C、E和F高度顯著，因素D顯著，因素A不顯著，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響由強(qiáng)到弱表現(xiàn)為C＞E＞B＞F＞D＞A。通過(guò)比較各因素不同水平的K值確定優(yōu)水平，因素B、C、D、E和F分別選B4、C4、D1、E2和F2，因素A的水平改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，從經(jīng)濟(jì)角度考慮選A1，因此最優(yōu)組合為A1B4C4D1E2F2，即MA23的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖0.8%，蛋白胨0.2%，可溶性淀粉3.5%，NaNO30.05% ，K2HPO40.2% ，MgSO40.2% ，CaCO30.12%，MnSO40.035%。保持發(fā)酵條件不變，采用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)酵，優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵液中的菌體量為1.96×109CFU/mL，較初始發(fā)酵培養(yǎng)基菌體量(1.39×109CFU/mL)提高了41%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表1

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌體量的影響 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH，以5%的接種量和70 mL的裝液量在30℃下180 r/min發(fā)酵48 h，不同初始pH發(fā)酵液中的活菌數(shù)如圖1所示。發(fā)酵液中的活菌數(shù)隨pH的升高先增加后降低；當(dāng)初始pH 6.5時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最高，為2.26×109CFU/mL，顯著高于其他初始pH發(fā)酵液中的活菌數(shù)，分別比相鄰2個(gè)初始pH 6.3和pH 6.8發(fā)酵液中的活菌數(shù)高6.3%和3.8%。

圖1 初始pH對(duì)菌體量的影響

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)菌體量的影響 培養(yǎng)基初始pH 6.5，以5%的接種量和70 mL的裝液量在不同溫度下180 r/min發(fā)酵48 h，不同溫度下發(fā)酵液中的活菌數(shù)如圖2所示。隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最高，為2.27×109CFU/mL，顯著高于其他發(fā)酵溫度下發(fā)酵液中的活菌數(shù)，且分別比2個(gè)相鄰發(fā)酵溫度28℃和33℃發(fā)酵液中的活菌數(shù)高出11.3%和12.1%。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)菌體量的影響

2.2.3 接種量對(duì)菌體量的影響 培養(yǎng)基初始pH 6.5，以不同的接種量和70 mL的裝液量在30℃下180 r/min發(fā)酵48 h，不同接種量發(fā)酵液中的活菌數(shù)如圖3所示。發(fā)酵液中的活菌數(shù)隨接種量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)接種量為8%時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最高，為2.48×109CFU/mL，與接種量為10%的發(fā)酵液中的活菌數(shù)相比無(wú)顯著性差異，但是顯著高于其他接種量的發(fā)酵液中的活菌數(shù)，比接種量為12%和5%的發(fā)酵液中的活菌數(shù)分別高出8.8%和10.5%。

圖3 接種量對(duì)菌體量的影響

2.2.4 搖瓶裝液量對(duì)菌體量的影響 培養(yǎng)基初始pH 6.5，以8%的接種量和不同的裝液量在30℃下180 r/min發(fā)酵48 h，不同裝液量發(fā)酵液中的活菌數(shù)如圖4所示。發(fā)酵液中的活菌數(shù)隨裝液量的增加先升高后降低；裝液量為70 mL時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最高，為2.50×109CFU/mL，明顯高于其他裝液量，比裝液量為50 mL和80 mL發(fā)酵液中的活菌數(shù)分別高8.4%和8.1%。

圖4 裝液量對(duì)菌體量的影響

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體量的影響 培養(yǎng)基初始pH 6.5，以8%的接種量和70 mL的裝液量在30℃下以不同的轉(zhuǎn)速發(fā)酵48 h，不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵液中的活菌數(shù)如圖5所示。隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，活菌數(shù)量先增加后降低，且當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)最高，達(dá)到2.51×109CFU/mL，顯著高于其他轉(zhuǎn)速下發(fā)酵液中的活菌數(shù)，比相鄰2個(gè)轉(zhuǎn)速160、200 r/min發(fā)酵液中的活菌數(shù)分別高18.9%和7.2%。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體量的影響

2.3 抑菌活性測(cè)定

以Psa為指示菌，研究培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)蠟樣芽孢桿菌MA23發(fā)酵液抑菌活性的影響（如表3所示）。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)正交優(yōu)化后，發(fā)酵液的菌體量和抑菌活性都有較大幅度的提高，較正交優(yōu)化前分別提高了41.0%和37.2%。利用優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵液的菌體量和抑菌活性得到了進(jìn)一步的提高，分別提高了28.2%和25.6%（圖6）。

圖6 優(yōu)化前后對(duì)Psa抑菌效果對(duì)比

表3 優(yōu)化前后菌體量及抑菌圈大小比較

3 結(jié)論

本研究通過(guò)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)分別對(duì)蠟樣芽孢桿菌MA23的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖0.8%，蛋白胨0.2%，可溶性淀粉3.5%，NaNO30.05%，K2HPO40.2%，MgSO40.2%，CaCO30.12%，MnSO40.035%，最佳發(fā)酵條件為初始pH 6.5，發(fā)酵溫度30℃，接種量8%，容積250 mL搖瓶的裝液量為70 mL，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，蠟樣芽孢桿菌MA23的菌體量和抑菌活性均得到大幅度的提高，為其發(fā)酵條件逐級(jí)放大及下游產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供參考，將有效推動(dòng)其在獼猴桃潰瘍病田間防治中的應(yīng)用。

4 討論

研究表明，蠟樣芽孢桿菌可以有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌、絲狀真菌和酵母菌，但其對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用卻鮮有報(bào)道[30-31]。本研究的前期研究結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌MA23對(duì)革蘭氏陰性菌Psa具有顯著的抑制作用。因此，優(yōu)化蠟樣芽孢桿菌MA23發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，提高其菌體量和抑菌活性，將為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

采用方差分析正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分析出實(shí)驗(yàn)誤差的大小，從而知道實(shí)驗(yàn)精度；不僅可給出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序，還可分析各因素影響的顯著性。蠟樣芽孢桿菌MA23培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響由主到次的順序?yàn)榭扇苄缘矸郏綤2HPO4＞蛋白胨＞MgSO4＞NaNO3＞葡萄糖，而且蛋白胨、可溶性淀粉、K2HPO4和MgSO4為高度顯著因素，NaNO3為顯著因素，葡萄糖為不顯著因素。對(duì)于顯著因素，選取優(yōu)水平并在實(shí)驗(yàn)中加以嚴(yán)格控制；對(duì)不顯著因素，可視具體情況確定優(yōu)水平。因此從經(jīng)濟(jì)角度考慮，將葡萄糖的優(yōu)水平確定為0.8%，其他因素參考各水平的K值，最終確定最優(yōu)培養(yǎng)基為A1B4C4D1E2F2，即葡萄糖0.8%，蛋白胨0.2%，可溶性淀粉3.5%，NaNO30.05%，K2HPO40.2%，MgSO40.2%。作為速效碳源的葡萄糖對(duì)發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響沒(méi)有顯著性，而作為遲效碳源的可溶性淀粉對(duì)發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響高度顯著，而且，當(dāng)可溶性淀粉為最高水平時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最高，說(shuō)明0.8%的葡萄糖已經(jīng)滿足蠟樣芽孢桿菌MA23對(duì)速效碳源的需求，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，蠟樣芽孢桿菌MA23更多地利用可溶性淀粉這一遲效碳源。

微生物的發(fā)酵機(jī)理復(fù)雜，且受多種因素的影響，除發(fā)酵培養(yǎng)基組成外，發(fā)酵條件（pH、溫度、接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速等）也是影響微生物發(fā)酵產(chǎn)物生成量的關(guān)鍵因素[32]。其中，培養(yǎng)基pH可以影響菌體細(xì)胞膜帶電荷的狀態(tài)、細(xì)胞膜的通透性及培養(yǎng)基組分的解離，從而影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及其生長(zhǎng)；溫度主要通過(guò)改變酶反應(yīng)速率、細(xì)胞膜的流動(dòng)性及物質(zhì)的溶解度影響菌體的生長(zhǎng)，且不同微生物的最適生長(zhǎng)溫度不同；而接種量與微生物生長(zhǎng)繁殖密切相關(guān)，適當(dāng)?shù)慕臃N量有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖；裝液量直接影響菌體和空氣的接觸，進(jìn)而影響培養(yǎng)基中的溶氧和菌體的生長(zhǎng)繁殖；搖床轉(zhuǎn)速直接影響培養(yǎng)基中的通氣量，從而影響菌體生長(zhǎng)。本研究通過(guò)搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化得到蠟樣芽孢桿菌MA23的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH 6.5，發(fā)酵溫度30℃，接種量為8%，裝液量為70 mL，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。在優(yōu)化后的條件下，菌株MA23發(fā)酵液中的最高活菌數(shù)可達(dá)到2.51×109CFU/mL。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌株MA23的菌體量和抑菌活性都得到大幅提高。其中，培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌株MA23發(fā)酵液的菌體量和抑菌活性分別提高了41%和37.2%。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步發(fā)酵條件優(yōu)化后，菌株MA23發(fā)酵液的菌體量和抑菌活性分別提高了28.2%和25.6%。

蠟樣芽孢桿菌MA23對(duì)Psa具有較好的抑制效果，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化，其抑菌活性得到了大幅提高。但是，發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化不是一蹴而就的，隨著發(fā)酵培養(yǎng)的進(jìn)一步放大，需要結(jié)合多種方法進(jìn)行多次優(yōu)化，以進(jìn)一步獲得更優(yōu)的結(jié)果。因此，今后應(yīng)在正交優(yōu)化的基礎(chǔ)上，結(jié)合多種優(yōu)化方法，進(jìn)一步優(yōu)化其放大培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，提高其抑菌活性，降低生產(chǎn)成本。