鹽堿脅迫下外源H2O2對(duì)毛白楊生理特性的影響

任金蘭

（山西省關(guān)帝山國(guó)有林管理局屯蘭川林場(chǎng)，山西古交030208）

0 引言

土壤鹽堿化是造成土壤肥力降低的主要因素[1]。據(jù)報(bào)道，世界鹽堿化土壤面積達(dá)到了9.54×108hm2，中國(guó)鹽堿化土地面積也達(dá)到了3.7×107hm2，土壤鹽堿化已經(jīng)成為毛白楊人工造林的限制因子[2]，研究外源過(guò)氧化氫對(duì)復(fù)鹽脅迫下毛白楊的生理響應(yīng)機(jī)制，可以為毛白楊鹽堿地人工造林提供理論依據(jù)。從關(guān)帝山林區(qū)調(diào)研結(jié)果看，NaCl和NaHCO3是造成土壤鹽堿化的主要物質(zhì)[3]。胡化廣[4]研究了鹽堿脅迫下結(jié)縷草生理變化，結(jié)果表明，結(jié)縷草CAT活性、脯氨酸含量、電導(dǎo)率均表現(xiàn)出升高的變化，SOD、可溶性糖表現(xiàn)出先升高后降低的變化；崔雪梅[5]研究認(rèn)為，鹽堿脅迫抑制了油菜的生長(zhǎng)，顯著提高了葉片內(nèi)的可溶性糖含量，脯氨酸含量雖然升高但是與對(duì)照之間無(wú)顯著差異；張若晨[6]研究了鹽堿脅迫下大果櫸幼苗保護(hù)酶活性變化，結(jié)果表明，隨著鹽堿濃度的增加，POD、SOD活性表現(xiàn)出先升高后降低的變化；袁馳[7]研究了水稻對(duì)鹽堿脅迫的影響規(guī)律，結(jié)果表明，丙二醛、脯氨酸均隨著鹽堿濃度的增加而升高。鹽堿脅迫相關(guān)研究集中在鹽堿對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響，關(guān)于鹽堿脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)季節(jié)影響的相關(guān)報(bào)道較少。毛白楊是山西省人工林建設(shè)的主要樹(shù)種[8]，研究毛白楊耐鹽堿的理論基礎(chǔ)具有重要的實(shí)踐意義。過(guò)氧化氫是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫的重要信號(hào)分子[9]，Bright[10-11]研究認(rèn)為，外源 H2O2可以有效緩解逆境下黃瓜葉綠體膜的傷害；Andre-dias[12]研究認(rèn)為，外源H2O2可以提高玉米的耐鹽性；劉建新[13]研究認(rèn)為，H2O2提高了燕麥的耐堿性，這可能與外源H2O2會(huì)影響植物基因表達(dá)有關(guān)[14]。在前人的相關(guān)研究中鮮見(jiàn)鹽堿脅迫下外源過(guò)氧化氫對(duì)毛白楊生理響應(yīng)機(jī)制影響的報(bào)道。筆者通過(guò)研究外源過(guò)氧化氫對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊的生理活性物質(zhì)的影響，探討外源過(guò)氧化氫提高植物抗逆性的機(jī)理，旨在為改進(jìn)栽培措施提高毛白楊抗逆性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

室外試驗(yàn)于2019年4—8月在屯蘭川林場(chǎng)試驗(yàn)苗圃內(nèi)全日光溫室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)生理指標(biāo)測(cè)驗(yàn)于取樣后第2～5天在生理生化實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所選毛白楊為1年生扦插苗，該苗木于2018年4月在苗圃內(nèi)扦插育苗，至2019年4月自然條件下生長(zhǎng)1年。2019年4月6日，人工用鐵鍬起苗，然后用自來(lái)水洗凈根系上的泥土，用吸水紙保濕備用。準(zhǔn)備口徑32 cm、深40 cm的塑料盆，裝好珍珠巖，然后將洗凈的毛白楊苗木栽植其中，每盆栽植1株。栽植完成后，每盆澆500 mL的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[15]，然后全部置于日光溫室內(nèi)培養(yǎng)，每隔4天澆水1次，防止苗木發(fā)生干旱脅迫，一直培養(yǎng)至6月25日進(jìn)行鹽堿脅迫處理。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4個(gè)處理，H1為對(duì)照，處理時(shí)澆灌等量的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；H2為營(yíng)養(yǎng)液與鹽堿溶液處理，Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+80 mmol/L NaHCO3+60 mmol/L NaCl；H3為鹽堿脅迫+過(guò)氧化氫處理，即Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+80mmol/LNaHCO3+60mmol/LNaCl+100μmol/L H2O2；H4為營(yíng)養(yǎng)液+過(guò)氧化氫處理，即Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 μmol/L H2O2。自2019年6月25日開(kāi)始，每盆澆灌試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溶液400 mL，每隔3天澆1次，澆灌3次后的第2天（即7月4日）取樣一次，澆灌6次后的第2天（即7月16日）取樣一次，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)變化情況。試驗(yàn)所選用NaHCO3和NaCl均為分析純，所選用的H2O2為30%濃度。試驗(yàn)每處理共30盆，3次重復(fù)，各處理在溫室內(nèi)隨機(jī)排列。

1.4 試驗(yàn)取樣及測(cè)定項(xiàng)目

分別于7月4、16日取樣，每處理隨機(jī)選擇6株苗木，將全部葉片摘取后放入液氮中冷凍保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。其中超氧陰離子測(cè)定采用羥胺氧化法[16]，H2O2含量測(cè)定采用分光光度法[17]，相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[16]，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[17]，SOD活性測(cè)定采用NBT光化還原法[18]，CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法[18]，POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[18]，APX活性采用紫外分光光度法[18]，ASA含量測(cè)定采用紅菲咯啉比色法[18]，GSH含量測(cè)定采用TDNB法[18]，可溶性糖測(cè)定采用蒽酮比色法[18]，可溶性蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]，游離脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮法[18]。

1.5 試驗(yàn)儀器及試劑

試驗(yàn)所用紫外光分光光度計(jì)型號(hào)為2102C型，由尤尼柯（上海）儀器有限公司生產(chǎn)，2017年3月購(gòu)入；茚三酮由上海芃碩生物科技有限公司生產(chǎn)，2019年1月購(gòu)入；硫代巴比妥酸由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，2019年1月購(gòu)入；30%過(guò)氧化氫由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，2019年3月購(gòu)入；DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀于2019年2月從上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司購(gòu)入。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析以及表格制作使用Excel 2010版軟件，方差分析使用DPS 7.05軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2O2對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊超陰離子和內(nèi)源H2O2含量的影響

由表1可知，隨著鹽堿溶液處理次數(shù)增加，超氧陰離子和過(guò)氧化氫含量增加，不同處理間存在差異。從超氧陰離子含量變化看，7月4日和7月16日，H2處理處于最高值，與H1處理相比分別提高了1.83、2.07 μg/g，差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內(nèi)的超氧陰離子含量；H3處理與H2處理相比分別降低了0.53、0.67 μg/g，差異顯著，表明外源H2O2可以降低葉片內(nèi)超氧陰離子含量，效果顯著；H3與H4相比分別提高了1.36、1.45 μg/g，說(shuō)明在相同H2O2處理下，鹽堿脅迫導(dǎo)致毛白楊超氧陰離子含量的顯著升高；H4處理分別低于H1處理0.06、0.07 μg/g，無(wú)顯著差異，說(shuō)明一定濃度的外源H2O2不會(huì)對(duì)毛白楊葉片內(nèi)的超氧陰離子產(chǎn)生顯著影響。從內(nèi)源過(guò)氧化氫含量變化看，H2處理分別比H1處理提高了1.28、1.45 mg/g，差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫會(huì)顯著提高毛白楊葉片內(nèi)的內(nèi)源H2O2含量；H3處理分別比H2處理降低了0.71、0.69 mg/g，差異顯著，說(shuō)明外源H2O2會(huì)顯著降低毛白楊葉片內(nèi)源H2O2含量；H4處理分別低于H2處理0.12、0.16 mg/g，無(wú)顯著差異，說(shuō)明外源H2O2在一定程度上會(huì)降低毛白楊葉片內(nèi)內(nèi)源H2O2含量，但是效果不顯著。

表1 毛白楊超氧陰離子和內(nèi)源H2O2含量分析表

2.2 外源H2O2對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量的影響

由表2可知，隨著鹽堿溶液澆灌量的增加，毛白楊相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均升高。從相對(duì)電導(dǎo)率變化看，7月4、16日，H2處理分別高于H1處理57.84和52.87個(gè)百分點(diǎn)，差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內(nèi)的相對(duì)電導(dǎo)率；H3處理分別比H2處理降低了7.50和4.53個(gè)百分點(diǎn)，無(wú)顯著差異，表明外源H2O2對(duì)緩解鹽堿脅迫降低相對(duì)電導(dǎo)率有一定的作用，但是效果不顯著；H4處理分別低于H1處理6.46和7.53個(gè)百分點(diǎn)，無(wú)顯著差異，表明外源H2O2對(duì)降低毛白楊葉片相對(duì)電導(dǎo)率具有一定的作用。從MDA含量變化看，H2處理分別比H1處理提高了7.90、9.73 nmol/g，差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片相對(duì)電導(dǎo)率；H3處理分別低于H2處理1.20、1.76 nmol/g，無(wú)顯著差異，說(shuō)明外源H2O2有利于降低毛白楊的MDA含量；H4處理分別高于H1處理1.02、1.12 nmol/g，差異不顯著，說(shuō)明外源H2O2一定程度上會(huì)提高毛白楊葉片內(nèi)MDA含量，但是效果不顯著。H4處理相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均顯著低于H2處理，并且與H1處理之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明外源H2O2對(duì)毛白楊的影響顯著小于鹽堿脅迫。從相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量變化看，外源H2O2一定程度上可以緩解鹽堿脅迫對(duì)毛白楊細(xì)胞膜的傷害。

表2 毛白楊相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量分析表

2.3 外源H2O2對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊保護(hù)酶活性的影響

由表3可知，毛白楊葉片內(nèi)保護(hù)酶活性隨著鹽堿處理次數(shù)的增加而升高，不同保護(hù)酶對(duì)外源H2O2的響應(yīng)存在差異。從SOD活性變化看，7月4、16日H2分別比H1提高了5.88、9.13 U/g，差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內(nèi)的SOD活性；H3處理分別高于H2處理4.52、5.52 U/g，差異顯著，說(shuō)明外源H2O2與無(wú)H2O2處理相比可以顯著提高SOD活性，對(duì)降低毛白楊鹽堿脅迫具有重要作用；H4處理分別高于對(duì)照3.10、4.36 U/g，無(wú)顯著差異，表明外源H2O2對(duì)提高毛白楊SOD活性具有一定的促進(jìn)作用，但效果不顯著。H2處理POD活性與H1相比分別提高了1.67、6.85 U/g，H3處理分別比H2處理提高了3.11、1.28 U/g，差異顯著，說(shuō)明外源H2O2對(duì)提高鹽堿脅迫下毛白楊POD活性效果顯著；H4處理POD活性與對(duì)照之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明外源H2O2與H1處理相比不會(huì)對(duì)毛白楊POD活性產(chǎn)生顯著影響。CAT活性變化與POD相同，其中H2處理分別高于H1處理1.10、1.81 U/g，差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫提高了毛白楊CAT活性；H3處理分別高于H2處理2.37、1.20 U/g，差異顯著，說(shuō)明外源H2O2會(huì)對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊CAT活性產(chǎn)生顯著影響；H4處理分別高于H1處理0.28、0.15 U/g，無(wú)顯著差異，說(shuō)明外源H2O2與H1處理相比不會(huì)顯著影響毛白楊CAT活性。鹽堿脅迫提高了毛白楊A(yù)PX活性，其中H2處理分別比H1處理提高了2.30、2.20 U/g，差異顯著；H3處理分別高于H2處理3.20、3.18 U/g，差異顯著，表明外源H2O2對(duì)提高APX活性具有顯著作用；H4處理分別高于H1處理0.77、0.65 U/g，無(wú)顯著差異，說(shuō)明一定濃度的外源H2O2不會(huì)對(duì)APX產(chǎn)生顯著影響。

表3 毛白楊保護(hù)酶活性變化分析表 U/g

2.4 外源H2O2對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊活性氧清除系統(tǒng)的影響

由表4可知，AsA和GSH含量隨著鹽堿處理次數(shù)的增加而升高，不同處理對(duì)2種生理活性物質(zhì)含量的影響也存在差異。7月4、16日，H2處理AsA分別高于H1處理0.25、0.27 mg/g，無(wú)顯著差異，說(shuō)明鹽堿脅迫提高了AsA含量，但效果不顯著；H3處理分別高于H2處理0.76、0.86 mg/g，無(wú)顯著差異，說(shuō)明外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比對(duì)提高AsA含量有一定作用，但是效果不顯著，與H1處理相比顯著提高了AsA含量；H4處理分別比H1處理提高了2.40、2.21 mg/g，差異顯著，說(shuō)明外源H2O2與H1處理相比顯著提高了AsA含量。GSH含量變化與AsA存在差異，其中H2處理分別比H1處理提高了0.08、0.10 mg/g，差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內(nèi)GSH含量；H3處理分別低于H2處理0.02、0.03 mg/g，無(wú)顯著差異，表明外源H2O2對(duì)降低鹽堿脅迫下GSH含量有一定的作用；H4處理分別低于H1處理0.06、0.04 mg/g，其中7月4日差異顯著，說(shuō)明外源H2O2與H1處理相比對(duì)降低毛白楊葉片GSH含量具有一定的作用。

表4 毛白楊A(yù)sA和GSH含量分析表 mg/g

2.5 外源H2O2對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊滲透物質(zhì)含量的影響

由表5可知，隨著鹽堿脅迫處理次數(shù)的增加，毛白楊滲透物質(zhì)含量升高，不同處理對(duì)滲透物質(zhì)含量的影響存在差異。7月4、16日，H2處理可溶性糖含量分別比H1處理提高了96.74、110.82 mg/g，差異顯著，表明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊可溶性糖含量；H3處理分別低于H2處理29.82、27.27 mg/g，其中7月4日2個(gè)處理之間差異顯著，7月16日差異不顯著，說(shuō)明外源H2O2有利于緩解鹽堿脅迫并降低可溶性糖含量；H4處理分別高于H1處理14.92、9.58 mg/g，其中7月4日差異顯著，7月16日差異不顯著，同時(shí)，H4處理顯著低于H2、H3處理。H2處理可溶性蛋白含量分別高于H1處理1.45、0.97 mg/g，差異顯著，表明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊可溶性蛋白含量；7月4日，H3處理高于H2處理1.66 mg/g，差異顯著，表明外源H2O2在7月4日可以顯著提高毛白楊葉片內(nèi)可溶性蛋白含量，7月16日H3處理低于H2處理0.56 mg/g，無(wú)顯著差異，表明外源H2O2在7月16日不會(huì)對(duì)可溶性蛋白產(chǎn)生顯著影響。游離脯氨酸含量H2處理分別高于H1處理3.87、3.56 mg/g，差異顯著，表明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊滲透物質(zhì)含量；H3處理分別高于H2處理5.85、8.11 mg/g，差異顯著，表明外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比顯著提高了毛白楊游離脯氨酸含量；H4處理分別比H1處理提高了2.42、4.56 mg/g，差異顯著，表明外源H2O2會(huì)顯著提高毛白楊游離脯氨酸含量。

表5 毛白楊滲透物質(zhì)含量分析表 mg/g

3 結(jié)論

（1）鹽堿脅迫會(huì)顯著提高毛白楊葉片內(nèi)超氧陰離子和過(guò)氧化氫含量，外源H2O2處理與鹽堿脅迫處理相比顯著降低了超氧陰離子和過(guò)氧化氫含量，外源H2O2處理與對(duì)照相比不會(huì)對(duì)超氧陰離子和過(guò)氧化氫含量產(chǎn)生顯著影響。

（2）鹽堿脅迫會(huì)顯著提高毛白楊相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，外源H2O2會(huì)降低相對(duì)電導(dǎo)率，對(duì)MDA含量影響不顯著；外源H2O2與對(duì)照相比不會(huì)對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量產(chǎn)生顯著影響。

（3）鹽堿脅迫顯著提高了SOD、APX活性，外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比均可以提高毛白楊保護(hù)酶活性；外源H2O2與對(duì)照相比不會(huì)對(duì)SOD和APX活性產(chǎn)生顯著影響，顯著提高POD、CAT活性。

（4）鹽堿脅迫不會(huì)顯著影響AsA含量，外源H2O2與鹽堿處理相比提高了AsA含量，與對(duì)照相比提高效果顯著；鹽堿脅迫顯著提高了GSH含量，外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比降低了GSH含量，外源H2O2與對(duì)照相比不會(huì)對(duì)GSH含量產(chǎn)生顯著影響。

（5）鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量，外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比降低了可溶性糖含量，顯著提高了可溶性蛋白、游離脯氨酸含量；外源H2O2與對(duì)照相比顯著提高毛白楊滲透物質(zhì)含量。

（6）從毛白楊抗逆機(jī)理看，外源H2O2可以緩解鹽堿脅迫，提高活性氧清除系統(tǒng)活性，調(diào)節(jié)滲透平衡。

4 討論

武敬亮[19]研究認(rèn)為，植物在鹽堿脅迫下膜脂過(guò)氧化水平會(huì)顯著升高，使植物細(xì)胞膜受到破壞，從而影響其功能的發(fā)揮，嚴(yán)重時(shí)植物會(huì)死亡。本試驗(yàn)研究中，鹽堿脅迫均顯著提高了毛白楊超氧陰離子和內(nèi)源H2O2含量，說(shuō)明鹽堿脅迫導(dǎo)致氧負(fù)基離子的積累，而過(guò)多的氧負(fù)離子積累不僅會(huì)對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成不可逆的傷害，也會(huì)嚴(yán)重抑制光合作用的進(jìn)行，從而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[20]。外源H2O2可以顯著降低超氧陰離子和內(nèi)源過(guò)氧化氫含量，從而降低毛白楊相對(duì)電導(dǎo)率，延緩MDA積累，這與劉建新[21]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明外源H2O2對(duì)降低毛白楊鹽堿脅迫下膜脂過(guò)氧化水平，以保護(hù)膜系統(tǒng)不受傷害，維持植物體正常生理代謝的進(jìn)行。從SOD的作用看，其活性的提高可以將更多的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和氧氣，而其他保護(hù)酶通過(guò)協(xié)同作用將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水，AsA和GSH直接參與過(guò)氧化氫的轉(zhuǎn)化，因此保護(hù)酶活性的提高可以防止植物遭受逆境傷害[22]。本研究中，外源H2O2均提高了毛白楊各保護(hù)酶活性，其中SOD和APX均達(dá)到了顯著水平，說(shuō)明外源過(guò)氧化氫在一定程度上可以提高超氧負(fù)離子和內(nèi)源過(guò)氧化氫的轉(zhuǎn)化效率，從而緩解毛白楊在鹽堿脅迫下受到的傷害[23]。谷文英[24]研究認(rèn)為，保護(hù)酶活性提高可以促進(jìn)鹽堿脅迫下植物逆境蛋白的表達(dá)，從而有利于植物抗逆性提高；從毛白楊鹽堿脅迫生理響應(yīng)機(jī)制看，SOD、POD、APX、CAT在鹽堿脅迫下均會(huì)顯著升高，這與張曉龍[25]的研究結(jié)果相似，表明逆境脅迫下植物保護(hù)酶活性升高是毛白楊對(duì)鹽堿脅迫的重要生理響應(yīng)機(jī)制。張波[26]研究認(rèn)為，外源H2O2對(duì)提高小麥可溶性糖含量效果顯著，同時(shí)也可以顯著提高GSH含量來(lái)提高植株的抗逆能力，而本研究與之存在差異，這可能與不同植物對(duì)外源過(guò)氧化氫的生理響應(yīng)機(jī)理不同有關(guān)。從本試驗(yàn)研究結(jié)果看，外源H2O2顯著提高了可溶性蛋白含量，對(duì)提高其抗鹽堿能力具有重要作用，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，除外源H2O2能促進(jìn)抗逆蛋白表達(dá)有關(guān)外，還與外源H2O2抑制活性氧產(chǎn)生，從而影響蛋白酶活性升高抑制了可溶性蛋白降解有關(guān)[27]。外源H2O2提高了毛白楊游離脯氨酸含量，這與武術(shù)杰[28]的研究結(jié)果相似，這與外源H2O2可以激活谷氨酸途徑和鳥(niǎo)氨酸途徑促進(jìn)游離脯氨酸的合成有關(guān)[29]。本研究探討了毛白楊對(duì)外源H2O2對(duì)鹽堿脅迫下毛白楊的生理響應(yīng)機(jī)制，在后續(xù)的研究中，需要圍繞毛白楊生理變化的機(jī)理進(jìn)行深入研究，這對(duì)填補(bǔ)相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究空白具有一定意義。