銀川大豆根腐病病原鑒定及種衣劑對(duì)其防治效果

杜宜新，石妞妞，阮宏椿，連金番，甘 林，陳福如

（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州350013；2寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，銀川750002）

0 引言

大豆是一種重要的油料、糧食和飼料作物，是植物蛋白和油脂的主要來源，是全球食物鏈的重要組成部分[1]。國內(nèi)大豆產(chǎn)量長期在1200萬t左右徘徊，而需求達(dá)到了10600萬t，接近90%的大豆需求份額依賴進(jìn)口[2]。大豆根腐病是一種世界性的土傳病害，主要侵染大豆莖基部至根部，引起根莖腐爛，一旦發(fā)生，一般田塊減產(chǎn)10%～30%，重病田塊減產(chǎn)達(dá)60%以上，嚴(yán)重時(shí)甚至造成絕產(chǎn)[3-4]，已成為影響大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一。已有研究表明，大豆根腐病是一種多病原復(fù)合侵染的病害，其病原種類繁多，主要為鐮刀菌(Fusariumspp.)、大豆疫霉菌(Phytophthora ojae)、腐霉菌(Pythium ultimum)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)，而在國內(nèi)大豆主產(chǎn)區(qū)造成根腐病的主要病原菌為鐮刀菌(Fusariumspp.)[5-9]。由鐮刀菌侵染引起的大豆根腐病可危害大豆生長發(fā)育的任何階段，播種后發(fā)芽前大豆種子被侵染后表現(xiàn)出水浸狀腐爛，影響種子的發(fā)芽率；幼苗受到侵染時(shí)發(fā)生猝倒枯死；成株期植株的根系受害時(shí)，出現(xiàn)水浸狀病斑，后期維管束變褐色，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)側(cè)根和主根全部腐爛，出現(xiàn)“禿根”癥狀，結(jié)莢減少，籽粒干癟，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益[10-12]。由于缺乏抗病性的大豆品種[13]，采用種衣劑包衣處理大豆種子仍是防治大豆根腐病最主要的措施。張旭麗等[14]測定了7種種衣劑對(duì)大豆根腐病的防治效果，結(jié)果顯示36.8%阿·多·福（阿維菌素·多菌靈·福美雙）SC，18%?！た薙C和40%衛(wèi)福SC對(duì)大豆根腐病具有較好的防治效果。趙振邦等[15]研究表明，申嗪霉素和新美洲星的綜合表現(xiàn)效果良好。因此，明確大豆根腐病的病原，篩選對(duì)大豆根腐病防治效果好的種衣劑，對(duì)大豆產(chǎn)業(yè)具有重要意義。2018—2019年寧夏銀川部分地區(qū)大豆根腐病發(fā)病嚴(yán)重，一般地塊病苗率20%～30%，發(fā)病嚴(yán)重地塊的病苗率達(dá)60%以上。筆者采集并分離了該地區(qū)大豆根腐病的病原，測定了種衣劑對(duì)大豆根腐病的防治效果，旨在明確造成寧夏銀川地區(qū)大豆根腐病的病原，并篩選防治效果較好的種衣劑，以期為該地區(qū)大豆根腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 大豆根腐病病樣的采集

于2018—2019年在寧夏銀川賀蘭、興慶、永寧地區(qū)采集大豆根腐病病樣，每個(gè)地區(qū)采集相距20 km以上的3個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)采用5點(diǎn)取樣法采集15株病樣。

1.2 大豆根腐病病原菌的分離

采用組織分離法，先用清水沖洗病樣根部，然后用剪刀將病樣植株的根和莖基部剪成5 mm×5 mm的組織塊，用75%酒精表面消毒30 s，用1%的NaClO消毒1.5 min，用無菌水沖洗3次，然后將組織塊置于含有100 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)，3天后從生長的菌落邊緣挑取菌絲置于新的PDA培養(yǎng)基上，通過單孢分離的方法獲得病原菌的純培養(yǎng)，最后將純化好的菌落轉(zhuǎn)移到PDA斜面保存，待用[16]。

1.3 大豆根腐病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌置于PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)5天，觀察其菌落形態(tài)和顏色，分生孢子形態(tài)、厚垣孢子的有無及形態(tài)，通過光學(xué)顯微鏡(Nikon E100，Japan)測量100個(gè)大型分生孢子和小型分生孢子的大小[17]。

1.4 大豆根腐病病原菌的分子鑒定

根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，用植物真菌DNA提取試劑盒(Omega Biotech,Guangzhou，China)分別提取不同形態(tài)特征菌株的基因組DNA，用鐮刀菌通用引物F1(5’-ATTACTCCAGCATCCTTGC-3’))/F2(5’-TTTACAAC TCCCAAACCCC-3’)確定分離菌株中的鐮刀菌數(shù)量。用ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3’)、TEF-F(5’-ATGG GTAAGGAGGACAAGAC-3’)/TEF-R(5’-GGAAGT ACCAGTGATCATGTT-3’)分別擴(kuò)增供試菌株的ITS和TEF基因[18-19]。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括1 UTaqDNA polymerase，2.5 μL 10×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，50 ng DNA，上下游引物各0.2 μmol/L，用超純水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，ITS和TEF序列分別55℃和58℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠回收試劑盒回收純化后送上海生工測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果獲得同源性較高鐮刀菌的ITS和TEF序列，應(yīng)用MEGA6.06軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.5 致病性測定

利用柯赫法則對(duì)分離到的鐮刀菌進(jìn)行致病性測定。試驗(yàn)于2019年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所試驗(yàn)基地內(nèi)開展，每種鐮刀菌隨機(jī)選擇3個(gè)菌株開展致病性測定。將病原菌置于PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)7天，用滅菌毛筆和無菌水刷洗菌落，配制成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，采用蘸根法進(jìn)行接種試驗(yàn)[21-22]。用針刺法損傷健康大豆苗‘毛豆3號(hào)’植株根部，隨后將損傷的植株于1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液中浸泡30 min后移栽至裝有滅菌栽培基質(zhì)的育秧盤中，將育秧盤置于25～28℃、相對(duì)濕度70%～80%的溫室中培養(yǎng)，以無菌水浸泡的植株作為空白對(duì)照，每組設(shè)置3次重復(fù)，7天后每天觀察發(fā)病情況，14天后采用組織分離法分離病變部位病原菌，鑒定分離的病原菌。

1.6 種衣劑對(duì)大豆根腐病的防治試驗(yàn)

供試種衣劑及使用劑量見表1。試驗(yàn)于2019年在寧夏農(nóng)林科學(xué)院作物研究所試驗(yàn)基地內(nèi)開展，供試大豆品種為‘寧豆6號(hào)’，播種前拌種包衣用藥，晾干后播種。每個(gè)小區(qū)30 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，以不拌種大豆為對(duì)照。播種20、60天后分別調(diào)查供試種衣劑對(duì)大豆根腐病的防治效果。調(diào)查時(shí)采用5點(diǎn)取樣法取樣，各處理小區(qū)每點(diǎn)隨機(jī)挖取10株大豆植株，根據(jù)根和莖基部病情進(jìn)行分級(jí)并記錄。0級(jí)為植株莖基部和主須根均無病斑；1級(jí)為莖基部和主根上有少量病斑；3級(jí)為莖基部或主根上病斑較多，病斑面積占莖和根總面積的1/4～1/2；5級(jí)為莖基部及主根上病斑多且較大，病斑面積占莖基部和根總面積的1/2～3/4；7級(jí)為莖基部及主根上病斑連片，形成繞莖現(xiàn)象，但根系并未死亡；9級(jí)為根系壞死，植株地上部萎蔫或死亡。病情指數(shù)和防治效果按式(1)～(2)計(jì)算。

表1 供試種衣劑及其用量

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

分離獲得152株真菌，其中鐮刀菌126株，占分離總菌株的82.90%。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將126株鐮刀菌分為4種類型。

第Ⅰ種類型菌株17株，在PDA培養(yǎng)基25℃黑暗恒溫培養(yǎng)條件下氣生菌絲旺盛，呈絨毛狀，菌落初期白色至粉紅色，后期紅褐色（圖1 A1～A2）。在PDA培養(yǎng)基上，分生孢子少，大型分生孢子鐮刀形，彎曲，頂部細(xì)胞錐形，多數(shù)3～5個(gè)隔膜，(16.4～39.5)μm×(2.9～5.6)μm，小型分生孢子卵圓形至橢圓形，多無隔(9.5～17.8)μm×(2.8～5.4)μm，厚垣孢子單生或串生于菌絲上，球形至不規(guī)則形（圖1A3～A4）。

第Ⅱ種類型菌株65株，在PDA培養(yǎng)基25℃黑暗恒溫培養(yǎng)條件下氣生菌絲旺盛，呈絨毛狀，菌落白色（圖1 B1～B2）。產(chǎn)生大量大型和小型分生孢子；大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，頂部細(xì)胞鈍圓，0～3隔，(28.5～62.4)μm×(4.6～6.3)μm；小型分生孢子卵圓形至橢圓形，多無隔(4.3～16.4)μm×(2.2～5.2)μm（圖1 B3）。

第Ⅲ種類型菌株31株，在PDA培養(yǎng)基25℃黑暗恒溫培養(yǎng)條件下氣生菌絲呈絨毛狀，菌落白色至紫色（圖1 C1～C2）。產(chǎn)生大量大型和小型分生孢子；大型分生孢子鐮刀形，(14.2～35.6)μm×(3.9～6.2)μm；小型分生孢子卵圓形至橢圓形，多無隔，(4.9～12.9)μm×(2.8～5.3)μm（圖1 C3）。

第Ⅳ種類型菌株13株，在PDA培養(yǎng)基25℃黑暗恒溫培養(yǎng)條件下氣生菌絲呈絨毛狀，菌落白色至紫色（圖1 D1～D2）。小型分生孢子，卵圓形至橢圓形，0～2隔，(7.6～14.0)μm×(2.7～4.1)μm。大型分生孢子紡錘形，頂部細(xì)胞較尖，0～5隔，(12.7～29.5)μm×(3.4～5.4)μm，厚垣孢子單生或串生，卵圓形至不規(guī)則形（圖1 D3）。

圖1 4種類型大豆根腐病菌形態(tài)學(xué)特征

2.2 序列比對(duì)分析

類型Ⅰ鐮刀菌ITS序列的GeneBank登錄號(hào)分別為 MW051435、MW051436、MW051437，TEF序列的GeneBank登錄號(hào)分別為 MW011155、MW011156、MW011157。序列比對(duì)結(jié)果表明，其ITS序列與木賊鐮刀菌(F.equiseti)ITS序列(MT180475.1)的同源性均達(dá)到99.21%以上，其TEF序列與木賊鐮刀菌TEF序列(KT213292.1)的同源性均達(dá)到99.54%以上。根據(jù)ITS和TEF序列采用鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該類型鐮刀菌均與木賊鐮刀菌(F.equiseti)聚在同一分枝上（圖2～3）。依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，該類型的鐮刀菌被鑒定為木賊鐮刀菌(F.equiseti)。

類型Ⅱ鐮刀菌ITS序列GeneBank登錄號(hào)分別為MW051438、MW051439、MW051440，TEF序 列 的GeneBank登錄號(hào)分別為 MW011158、MW011159、MW011160。序列比對(duì)結(jié)果表明，其ITS序列與茄病鐮刀菌(F.solani)ITS序列(MK764995.1)的同源性達(dá)到98.85%以上，其TEF序列與茄病鐮刀菌的TEF序列(MH341208.1)的同源性達(dá)到99.28%以上。根據(jù)ITS和TEF序列采用鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該類型鐮刀菌均與茄病鐮刀菌(F.solani)聚在同一分枝上（圖2～3）。依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，該類型的鐮刀菌被鑒定為茄病鐮刀菌(F.solani)。

類型Ⅲ鐮刀菌ITS序列GeneBank登錄號(hào)分別為MW051441、MW051442、MW051443，TEF序 列GeneBank登 錄 號(hào)分 別 為 MW011161、MW011162、MW011163。序列比對(duì)結(jié)果表明，其ITS序列與尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)ITS序列(MF136404.1)的同源性均達(dá)到95.26%以上，其TEF序列與尖孢鐮刀菌TEF序列(AB674272.1)的同源性達(dá)到99.24%以上。根據(jù)ITS和TEF序列采用鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該類型鐮刀菌均與尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)聚在同一分枝上（圖2～3）。依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，該類型的鐮刀菌被鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

類型Ⅳ鐮刀菌ITS序列GeneBank登錄號(hào)分別為MW051444、MW051445；TEF序列GeneBank登錄號(hào)分別為：MW011164、MW011165。序列比對(duì)結(jié)果表明，其ITS序列與短肥鐮刀菌(F.brachygibbosum)ITS序列(KR071881.1)的同源性達(dá)到99.61%，其TEF序列與短肥鐮刀菌TEF序列(MK361176)的同源性達(dá)到100%。根據(jù)ITS和TEF序列采用鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該類型鐮刀菌均與短肥鐮刀菌(F.brachygibbosum)聚在同一分枝上（圖2～3）。依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，該類型鐮刀菌被鑒定為短肥鐮刀菌(F.brachygibbosum)。

圖2 基于rDNA-ITS序列采用鄰近連接法構(gòu)建的鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 鐮刀菌的致病性

致病性測定結(jié)果表明，茄病鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)和短肥鐮刀菌(F.brachygibbosum)對(duì)大豆均有致病作用，造成根腐病癥狀，從接種后大豆根部分離的病原菌與接種病原菌在形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)特征方面表現(xiàn)一致。

2.4 種衣劑對(duì)大豆根腐病的防治效果

拌種施藥20天后對(duì)照處理的病情指數(shù)為19.32，6種種衣劑的防治效果均在65%以上，其中35%多菌靈·福美雙·克百威懸浮種衣劑2000 g/100 kg種子、38%多菌靈·福美雙·毒死蜱懸浮種衣劑1500 g/100 kg種子、25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑700 g/100 kg種子、20.5%多菌靈·福美雙·甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽懸浮種衣劑1500 g/100 kg種子的防治效果顯著優(yōu)于62.5 g/L精甲·咯菌腈浮種衣劑500 g/100 kg種子的防治效果。拌種施藥60天后對(duì)照處理的病情指數(shù)為50.91，各種衣劑的防治效果均低于60%，35%多菌靈·福美雙·克百威懸浮種衣劑2000 g/100 kg種子、25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑700 g/100 kg種子、20.5%多菌靈·福美雙·甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽懸浮種衣劑1500 g/100 kg種子與38%多菌靈·福美雙·毒死蜱懸浮種衣劑1500 g/100 kg種子、62.5 g/L精甲霜靈·咯菌腈浮種衣劑500 g/100 kg種子的防治效果相當(dāng)，優(yōu)于400 g/L萎銹靈·福美雙懸浮劑500 g/100 kg種子的防治效果。

3 結(jié)論與討論

大豆根腐病是由多種病原菌獨(dú)立或復(fù)合侵染引起的土傳病害，不同地區(qū)引發(fā)大豆根腐病的病原菌種類存在差異。目前國內(nèi)外已報(bào)道的病原菌主要為鐮刀菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(Pythium ultimum)、大豆疫霉菌(Phytophthora ojae)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)[23]。腐霉菌是日本大豆根腐病的主要病原菌[24]，白絹菌(Sclerotium rolfsii)、鐮刀菌(Fusariumspp.)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)是造成印度尼西亞大豆幼苗傾倒、莖基部腐爛和根腐的主要病原菌[25]。在國內(nèi)引起大豆根腐病的病原比較復(fù)雜，鐮刀菌為主要病原菌，不同地區(qū)鐮刀菌優(yōu)勢種存在差異。黃淮地區(qū)、山東省和新疆地區(qū)以茄病鐮刀菌為主，黑龍江省以尖孢鐮刀菌為主，陜西省漢中地區(qū)鐮刀菌為茄病鐮刀菌和芬芳鐮刀菌(F.redolens)，四川省尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌致病性較強(qiáng)[3,26-30]。筆者對(duì)寧夏銀川地區(qū)大豆根腐病的病原菌進(jìn)行了分離鑒定，沒有分離到大豆疫霉菌，分離出的鐮刀菌占比為82.90%，其中茄病鐮刀菌(F.solani)65株，占51.59%；尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)31株，占24.60%；木賊鐮刀菌(F.equiseti)17株，占13.49%；短肥鐮刀菌(F.brachygibbosum)13株，占10.32%。致病性測定的結(jié)果表明，茄病鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)和短肥鐮刀菌(F.brachygibbosum)均可對(duì)大豆致病，造成根腐病癥狀，表明這4種鐮刀菌均可造成大豆根腐病。本研究主要采集了寧夏銀川地區(qū)的大豆根腐病樣本，今后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本采集范圍，明確寧夏地區(qū)大豆根腐病菌的病原。

圖3 基于TEF序列采用鄰近連接法構(gòu)建的鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 7種種衣劑對(duì)大豆根腐病的防治效果

目前登記用于防治大豆根腐病的殺菌劑主要以精甲霜靈混配咯菌腈、多菌靈、福美雙為主，長期以來防治大豆根腐病的種衣劑缺乏新的成分和新的劑型。甲霜靈、精甲霜靈屬于苯基酰胺類殺菌劑主要用于抑制卵菌病害，對(duì)大豆疫霉、腐霉有抑制作用，而對(duì)鐮刀菌、立枯絲核菌沒有抑制作用?？┚媸侨鹗肯日_(dá)公司開發(fā)的一種新型苯基吡咯類殺菌劑，抑制孢子萌發(fā)的同時(shí)也能夠抑制菌絲的生長[6]，通過抑制Ⅲ型組氨酸激酶磷酸化，激活HOG-MAPK途徑，然后磷酸化下游目標(biāo)Ypd1，最終合成大量的甘油使細(xì)胞死亡[11-12]，對(duì)大部分真菌具有抑制作用，但對(duì)卵菌沒有抑制作用。本研究中，供試的6種種衣劑拌種施藥播種后20天對(duì)大豆根腐病的防效范圍為66.08%～75.65%，但是施藥60天后的防效均下降到60%以下，表明這6種種衣劑對(duì)以鐮刀菌為主要病原菌的根腐病有一定的防治效果，但持效期有限。因此，應(yīng)重點(diǎn)開發(fā)對(duì)大豆根腐病主要病原菌具有較強(qiáng)抑制效果、對(duì)大豆種子安全的新成分，同時(shí)開發(fā)緩釋劑，以提高種衣劑的防治效率、延長持效期，下一步將通過室內(nèi)毒力測定和盆栽試驗(yàn)篩選安全高效的殺菌劑防治大豆根腐病。

試驗(yàn)地對(duì)照處理在播種后60天的病情指數(shù)達(dá)50.91，在發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)僅依靠種衣劑難以防治大豆根腐病。因此，在大豆根腐病發(fā)生嚴(yán)重的地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)業(yè)管理，如推廣水旱輪作；完善排水系統(tǒng)，以降低田間濕度；及時(shí)進(jìn)行中耕培土，以促進(jìn)植株生長[23]等，同時(shí)加大生物防治的應(yīng)用，以保證寧夏銀川地區(qū)大豆產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。