活體監(jiān)測(cè)植物葡萄糖的微型傳感器研究*

楊 磊, 陳 達(dá), 王 成, 李愛學(xué)

(1.北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心，北京 100097；2.山東科技大學(xué) 電子信息工程學(xué)院，山東 青島 266590)

0 引 言

糖在植物生長(zhǎng)過程中起著至關(guān)重要的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，糖類還在信號(hào)傳導(dǎo)過程中具有激素類的信使功能[1]。因此，對(duì)植物中的糖進(jìn)行定量分析是非常重要的。傳統(tǒng)的植物可溶性糖測(cè)定方法有氣相色譜法[2]、液相色譜法[3]、近紅外光譜法[4]、熒光光譜法[5]等。然而，這些方法都是離體檢測(cè)，植物樣品的采集對(duì)植物體本身可能會(huì)造成某些不可逆轉(zhuǎn)的傷害。而且這些方法得到的結(jié)果往往反映了某一時(shí)刻的靜態(tài)濃度或累積效應(yīng)，不能反映植物體內(nèi)代謝物質(zhì)隨環(huán)境變化的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)信息。因此，需要開發(fā)新的方法來實(shí)時(shí)檢測(cè)植物中的糖。

電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、便攜性好、響應(yīng)速度快、易于集成等優(yōu)點(diǎn)[6，7]，近年來得到了較快發(fā)展。電化學(xué)生物傳感器已被用于活體實(shí)時(shí)檢測(cè)不同動(dòng)物體內(nèi)的葡萄糖、乙酰膽堿、多巴胺、ATP、膽固醇和谷氨酸[8]。一些電化學(xué)生物傳感器也被用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物體內(nèi)的H2O2或NO[9，10]。葡萄糖是植物體內(nèi)的一種重要的可溶性糖，在植物體內(nèi)含量較多，大部分植物體內(nèi)葡萄糖的含量在0到幾百毫摩爾每升范圍內(nèi)[11～14]。而目前發(fā)展的用于人體及動(dòng)物體的葡萄糖傳感器的檢測(cè)范圍較窄，一般僅能達(dá)到幾十毫摩爾每升[15～17]，不能用來進(jìn)行植物葡萄糖的檢測(cè)。目前更沒有能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)植物葡萄糖的電化學(xué)生物傳感器。

本文利用葡萄糖氧化酶(GOD)特異性催化葡萄糖，通過固定醋酸纖維素(CA)提高葡萄糖氧化酶的固載量，通過聚氨酯—環(huán)氧樹脂(PU-Epoxy)提高傳感器的選擇性和穩(wěn)定性，首次研制了一種適用于植物體內(nèi)葡萄糖濃度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的電化學(xué)微型傳感器。該葡萄糖傳感器具有較高的靈敏度和選擇性，以及良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。并利用所研制的生物傳感器成功地對(duì)蘆薈體內(nèi)的的葡萄糖含量變化進(jìn)行了實(shí)時(shí)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)品和材料

葡萄糖、醋酸纖維素(CA)、戊二醛(glutar)、蔗糖、乳糖、甘氨酸、山梨醇、果糖、半乳糖、聚氨酯(PU)、Epoxy(雙酚A，二縮水甘油醚)、葡萄糖氧化酶(GOD)、牛血清白蛋白(BSA)、棉子糖、半乳糖、果糖購自Sigma-Aldrich Co.(上海)。磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L, pH 7.4)購自北京Solarbio科技有限公司(北京)。所有其他化學(xué)品均為分析級(jí)，并購自北京化工廠(北京，中國(guó))。整個(gè)實(shí)驗(yàn)采用了超純水。

1.2 電鏡表征

采用清華大學(xué)高分辨蔡司場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(GEMINISEM 500)，加速電壓15 kV，獲得掃描電鏡(SEM)圖像。

1.3 PU-Epoxy/GOD/Glutar/CA/Pt微型傳感器制作方法

鉑(Pt)絲電極由天津艾達(dá)公司生產(chǎn)，鉑絲長(zhǎng)度約為1 cm，直徑約為0.5 mm。使用前，依次用1.0,0.05 μm氧化鋁拋光粉打磨鉑絲電極，在去離子水和無水乙醇中超聲5 min，然后用去離子水徹底沖洗干凈，氮?dú)獯蹈伞?/p>

將清潔的鉑絲電極浸入放置在2 %CA的丙酮溶液中浸泡2 min，然后放在空氣中干燥不同時(shí)間。之后將CA/Pt電極浸入2 %的戊二醛溶液4 h，再次洗滌自然干燥。然后將Glutar/CA/Pt電極放在不同濃度的GOD溶液中4 ℃孵育24 h。沖洗干燥后，將GOD/Glutar/CA/Pt電極浸入不同配比的PU-Epoxy溶液中浸泡2 s，取出后靜置5 min，重復(fù)不同次數(shù)，之后放置在室溫下干燥30 min，然后將電極放置在80 ℃恒溫干燥箱中固化20 min，取出后用PBS沖洗干凈晾干，得到PU-Epoxy/GOD/Glutar/CA/Pt電極。該微型傳感器的制作過程如圖1所示。

圖1 植物葡萄糖微型傳感器的制備過程示意

1.4 電化學(xué)測(cè)量

大部分電化學(xué)實(shí)驗(yàn)是在電化學(xué)工作站(CHI 660C,CH儀器，上海，中國(guó))進(jìn)行的，在室溫下進(jìn)行。在8通道CHI 1000C儀器上對(duì)鹽脅迫下蘆薈中的葡萄糖進(jìn)行了實(shí)時(shí)檢測(cè)。采用三電極系統(tǒng)。修飾后的鉑絲電極作為工作電極，Ag/AgCl絲作為參比電極，另一根潔凈的鉑絲電極作為對(duì)電極。

1.5 活體實(shí)驗(yàn)

供試蘆薈品種為“不夜城”，在大棚內(nèi)已生長(zhǎng)近3年。選取大小一致的蘆薈，實(shí)驗(yàn)前需統(tǒng)一放置在光照充足的環(huán)境中培養(yǎng)1個(gè)月。

將PU-Epoxy/GOD/Glutar/CA/Pt電極、Ag/AgCl電極和鉑絲電極分別插入蘆薈葉部2 mm左右的深度，確保不穿透葉片，原位測(cè)定蘆薈中葡萄糖含量。對(duì)于不同的植物，電極被盡可能地插入相同的位置。

在試驗(yàn)前和試驗(yàn)后，分別取10株蘆薈的葉片樣品，利用離子色譜法(北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所)測(cè)試其葡萄糖含量。并將微傳感器輸出與離子色譜法得到的葡萄糖含量數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，并利用兩點(diǎn)校準(zhǔn)法進(jìn)行葡萄糖含量的計(jì)算。葡萄糖含量(G)從G1到G2(g/100 g)，與傳感器輸出電流值為I1和I2(μA)，傳感器靈敏度S=(I2-I1)/(G1-G2)，傳感器理論輸出值I0(在沒有葡萄糖的情況下)=I1-(S(G1))。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖微型傳感器修飾過程的形貌分析

利用掃描電鏡(SEM)對(duì)Pt電極、CA/Pt電極、PU-Epoxy/GOD/Glutar/CA/Pt電極的形貌進(jìn)行表征。Pt電極的掃描電鏡圖(圖2(a))顯示其表面清潔并且光滑，無其他雜質(zhì)沉積于表面。如圖2(b)所示,當(dāng)CA修飾在在Pt電極上后，電極表面被覆蓋了一層均勻的CA膜，CA的分子形如"米粒狀"，其直徑約為10～15 μm。進(jìn)一步修飾戊二醛、GOD及PU-Epoxy膜后(圖2(c))，電極表面被一層致密的PU保護(hù)膜覆蓋，狀如彎曲的“腦回”，并具有孔狀結(jié)構(gòu)，孔的直徑約為1～3 μm，從而可以允許葡萄糖等分子通過。

圖2 SEM表征結(jié)果

進(jìn)一步利用電化學(xué)工作站采用循環(huán)伏安法(CV)和電化學(xué)阻抗譜法(EIS)對(duì)傳感器的各個(gè)制備步驟進(jìn)行了表征。圖3(a)顯示了每個(gè)修飾步驟的CV曲線。裸Pt電極表現(xiàn)出Fe[(CN)6]4-/3-的可逆氧化還原行為，CA層修飾在Pt電極上后，F(xiàn)e[(CN)6]4-/3-的氧化還原峰電流減小。進(jìn)一步修飾Glutar及GOD后，F(xiàn)e[(CN)6]4-/3-的氧化還原峰電流進(jìn)一步減小。這說明GOD通過Glutar成功地交聯(lián)到CA膜上。PU-Epoxy涂層在GOD/Glutar/CA/Pt電極上之后，F(xiàn)e[(CN)6]4-/3-的氧化還原峰電流進(jìn)一步減小，并且氧化還原曲線的可逆性變差，說明電極上已形成PU-Epoxy層。

圖3(b)則顯示了在電極修飾過程中阻抗變化，用一個(gè)簡(jiǎn)單的等效電路模型(圖3(b)中的插圖)來擬合阻抗譜。CA膜形成后，由于CA層阻斷了電極表面的電子轉(zhuǎn)移，電子轉(zhuǎn)移電阻較裸Pt電極顯著增加了24.3 kΩ。在GOD交聯(lián)到電極表面的CA膜后，由于制備的層結(jié)構(gòu)緊湊，Rct較之前明顯增加至86.8 kΩ。在電極上形成PU-Epoxy層后，對(duì)應(yīng)的Rct進(jìn)一步增加。

圖3 電極修飾過程中循環(huán)伏安曲線和Nyquist阻抗

2.2 葡萄糖微型傳感器的制備優(yōu)化

為了提高傳感器的性能，對(duì)傳感器的制備進(jìn)行了優(yōu)化。CA作為載體膜，能夠增加GOD的固定量。對(duì)其干燥時(shí)間(30,60,90,120,150 min)進(jìn)行了優(yōu)化，利用葡萄糖濃度為50 mmol/L測(cè)定其i-t響應(yīng)，如圖4(a)所示，干燥60 min時(shí)，電極可以獲得最高的電流響應(yīng)，因此，后續(xù)試驗(yàn)的干燥時(shí)間選為60 min。

利用酶催化的葡萄糖傳感器的分析性能高度依賴于GOD的用量，因此，針對(duì)不同濃度GOD(10,30,50,80,100 mg/mL)的優(yōu)化是必不可少的。如圖4(b)所示，應(yīng)用本修飾方法時(shí)，當(dāng)GOD濃度為80 mg/mL時(shí)，電極的電流響應(yīng)最高，所以GOD的最佳濃度確定為80 mg/mL。

聚氨酯—環(huán)氧樹脂(PU-Epoxy)具有多孔結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，PU-Epoxy涂層可以有效地限制葡萄糖分子的擴(kuò)散速率，減少氧含量的影響，同時(shí)還能抵抗其他生物分子的干擾[18]。針對(duì)聚氨酯與環(huán)氧樹脂的配比進(jìn)行了優(yōu)化，采用了PU∶Epoxy(4∶6,5∶5,6∶4,1∶0)的不同配比，在葡萄糖濃度為50 mmol/L測(cè)定其i-t曲線，如圖4(c)所示，可以看出電極在60 %環(huán)氧樹脂/40 %PU時(shí)，電流的響應(yīng)最高，所以認(rèn)為60 %環(huán)氧樹脂/40 %PU為最佳配比。其次針對(duì)電極在PU-Epoxy溶液中的浸泡次數(shù)(5,10,15,20,25次)也進(jìn)行了優(yōu)化，通過圖4(d)可以看出，當(dāng)浸泡次數(shù)為10次時(shí)，電流響應(yīng)最好，因此確定PU-Epoxy的浸泡次數(shù)為10次。

圖4 制備優(yōu)化

2.3 葡萄糖微型傳感器的性能測(cè)試

采用PU-Epoxy/GOD/Glutar/CA/Pt葡萄糖傳感器測(cè)定一系列濃度葡萄糖溶液的電流響應(yīng)。將該傳感器在PBS中得到穩(wěn)定電流后，用微量注射器將2 mol/L葡萄糖溶液逐滴滴加至PBS溶液中，直至200 mmol/L，圖5(a)顯示其隨時(shí)間的增加得到的葡萄糖濃度的電流響應(yīng)曲線圖，隨著葡萄糖濃度的增加，電流響應(yīng)值也越大, 右下插圖為取其中一段放大圖。圖5(b)顯示在葡萄糖濃度為1～200 mmol/L內(nèi)，葡萄糖濃度與電流值成線性關(guān)系。線性方程為y=0.0068x+0.081，R2為0.992。通過實(shí)際檢測(cè)，該傳感器能夠直接檢測(cè)到0.1 mmol/L的葡萄糖，表明葡萄糖的檢測(cè)限為0.1 mmol/L。該傳感器的檢測(cè)范圍為1～200 mmol/L，能夠覆蓋大多數(shù)植物體內(nèi)的葡萄糖含量，因此可以用于植物葡萄糖的活體檢測(cè)。

圖5 性能測(cè)試

同等實(shí)驗(yàn)條件下，采用同一根PU-Epoxy/GOD/Glutar/CA/Pt葡萄糖傳感器，每間隔600 s測(cè)一次50 mmol/L葡萄糖的PBS溶液，并記錄其葡萄糖溶液的電流響應(yīng)值，連續(xù)測(cè)定10次。可以得到其電流響應(yīng)值較為一致(RSD=8.85 %)。在同等實(shí)驗(yàn)條件下，同一根葡萄糖傳感器每間隔2天測(cè)一次50 mmol/L葡萄糖的PBS溶液，共測(cè)定9次，記錄其響應(yīng)電流值，27天后，電極電流響應(yīng)值仍與初始電流值相近。由此可知，該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

眾所周知，植物中還有其他的可溶性糖，如乳糖、半乳糖、蔗糖等，可能會(huì)干擾對(duì)葡萄糖的檢測(cè)。因此，對(duì)該傳感器的選擇性進(jìn)行了測(cè)試。如圖6所示，每種物質(zhì)測(cè)試600 s,可以看出，葡萄糖傳感器在保持對(duì)葡萄糖高靈敏度的同時(shí)，對(duì)其他的可溶性糖沒有明顯的響應(yīng)。其結(jié)果表明該傳感器具有良好的選擇性。

圖6 葡萄糖傳感器在0.01 mol/L PBS (pH 7.4)中連續(xù)添加50 mmol/L不同干擾物的i-t曲線:葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘氨酸、山梨醇 (依次從1到7)

2.4 蘆薈葉部葡萄糖濃度變化的活體實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

本實(shí)驗(yàn)用制備的微傳感器對(duì)蘆薈葉部葡萄糖濃度進(jìn)行了活體實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。如圖7所示，在測(cè)量的初始部分，傳感器先處于自穩(wěn)定階段直到17 h，在19 h到第二天的7 h，可以看出蘆薈體內(nèi)葡萄糖含量較低；從第二天的7～18 h，蘆薈體內(nèi)葡萄糖含量明顯增加，最大時(shí)為0.22 g/100 g，主要是由于白天植物自身的光合作用合成葡萄糖；18 h之后，蘆薈進(jìn)入夜晚時(shí)段，從圖中可以看出其呈明顯的下降趨勢(shì)，最低時(shí)測(cè)得蘆薈體內(nèi)葡萄糖含量為0.042 g/100 g，主要是由于蘆薈自身的呼吸作用消耗葡萄糖所致。結(jié)果表明研制的微型葡萄糖生物傳感器能夠測(cè)定蘆薈葉部葡萄糖的實(shí)時(shí)變化。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該傳感器獲得的信息能夠更好地反映植物體內(nèi)生理狀態(tài)的實(shí)時(shí)變化，且微傳感器的直徑僅有0.5 mm，實(shí)時(shí)結(jié)束后經(jīng)過長(zhǎng)期觀察，傳感器的使用并不影響植物的正常生長(zhǎng)。

圖7 蘆薈葉部葡萄糖濃度變化的活體實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

3 結(jié) 論

本文所研制的新型葡萄糖微型電化學(xué)生物傳感器，利用葡萄糖氧化酶(GOD)特異性催化葡萄糖，通過固定醋酸纖維素(CA)提高葡萄糖氧化酶的固載量，通過聚氨酯—環(huán)氧樹脂(PU-Epoxy)提高傳感器的選擇性和穩(wěn)定性，該傳感器的線性范圍寬，檢測(cè)限低，并且具有較高的靈敏度和選擇性、良好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性。并利用此傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了植物活體內(nèi)葡萄糖的含量變化，提供了植物體內(nèi)代謝物質(zhì)隨環(huán)境變化的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化的信息。下一步的工作將進(jìn)一步優(yōu)化該微型傳感器，并開發(fā)集成傳感系統(tǒng)，以期真正應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。