以水通道蛋白microRNA探討中醫(yī)外治惡性胸水研究進展

袁菊花，賈立群，婁彥妮，王 貴，鄭麗平，鄧海燕

(1. 北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100039；2. 中日友好醫(yī)院，北京 100029)

惡性胸水是惡性腫瘤常見的并發(fā)癥，主要由于腫瘤累及胸膜或原發(fā)胸膜腫瘤導致，臨床治療難度較大，嚴重影響患者生活質(zhì)量及預后。中醫(yī)將其歸屬于“懸飲”范疇。近年來,中醫(yī)治療惡性胸水的應用及研究日趨增多，內(nèi)服與外用并舉。而中醫(yī)外治法以其簡、便、效、廉優(yōu)勢,在臨床中運用越來越廣泛，但一直缺乏對于其作用機制的科學有力證據(jù)。本文通過對中醫(yī)外治之貼敷形式，通過對惡性胸水形成機制分析，并結(jié)合中醫(yī)治療之“利水”原則，探討若通過水通道蛋白(AQPs)為靶點，引入目前應用于論證中醫(yī)外治的微小RNA(miRNA)芯片技術(shù)，可在基因?qū)用娓玫亟沂局兴幫庵螑盒孕厮纳飳W作用基礎(chǔ),為臨床療效作用通路提供更為科學的依據(jù)，為今后的臨床和科研提供參考。

1 中醫(yī)對惡性胸水認識

《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》對惡性胸腔積液有十分形象的描述，“飲后水流在脅下，咳唾引痛，謂之懸飲”。唐·孫思邈《千金方痰飲第六》提出“五飲說”，其中“游飲，水游在兩脅下”，與懸飲相類似。癥瘕、積聚遷延日久，致肝、脾、腎功能失調(diào)，終致氣滯、血瘀、水停胸脅，若陽氣虛衰，氣不化津，則陰邪偏盛，水濕不化，實者愈實，故本虛標實，虛實交錯，是本病的主要病機特點。吳非澤[1]通過分析近20年相關(guān)文獻，惡性胸腔積液常見中醫(yī)證型有脾虛水停證、脾腎陽虛證、瘀水互結(jié)證、飲停胸脅證等，治療以“溫陽散結(jié)、行氣利水”為基本治法，選用具有瀉水逐飲、健脾益腎、利水滲濕、溫陽化飲、活血化瘀等功效中藥，均最終達到抑制水飲形成，清除水飲之目的。

中醫(yī)外治惡性胸水既可以遵從中醫(yī)辨證論治的原則,又能避免口服首過效應，特別是對無法口服中醫(yī)湯劑或消化道反應較重的患者，無疑是最好的選擇。所以近年來應用日趨增多。目前中醫(yī)治療惡性胸腔積液的外治方法多采用敷貼療法，其給藥途徑直接，藥力直接透皮吸收，能具有較好臨床療效。例如霍志剛等[2]將消水散(甘遂、桂枝、大戟、干姜、葶藶子、肉桂等)外敷治療惡性胸腔積液，可提高患者生活質(zhì)量。其另一項研究還顯示消水散外敷聯(lián)合順鉑胸腔內(nèi)灌注治療惡性胸腔積液能夠控制積液的生長,改善患者的免疫功能,減輕化療藥物不良反應[3]。賈立群等[4]予抗癌消水膏(牽牛子、桂枝、莪術(shù)、冰片等)外敷患側(cè)胸后壁，臨床有效率、癥狀改善率均高于干擾素胸腔注射對照組。王維等[5]將120 例肺癌惡性胸水患者隨機分為中藥組、順鉑(DDP) 組、重組人5型腺病毒組及聯(lián)合治療組，發(fā)現(xiàn)重組人5型腺病毒注射液胸腔內(nèi)灌注聯(lián)合攻癌利水散外敷對肺癌伴惡性胸水療效最佳，同時可顯著提高患者生活質(zhì)量。林青等[6]通過采用散結(jié)膏外敷聯(lián)合順鉑胸腔內(nèi)灌注化療治療癌性胸水68例，結(jié)果顯示治療組患者的臨床療效、生活質(zhì)量評分顯著優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05) 。

2 中醫(yī)外治法與miRNAs的相關(guān)性

歷來中醫(yī)研究者一直致力于尋求多種機制將中醫(yī)理論、病因病機、治則治法、臨床療效等科學化，而miRNAs的日益興起給了中醫(yī)研究更好的論證手段。miRNAs即小分子RNA，是一類具有調(diào)節(jié)作用的約22個核苷酸的非編碼RNA。在基因表達調(diào)控中，miRNA最大的特點是多個靶基因可以由一個miRNA進行調(diào)控，或者一個靶基因由多個miRNA協(xié)同調(diào)控。通過這兩種方式相互結(jié)合形成復雜精確的調(diào)控網(wǎng)絡，極大地增強了調(diào)控效率[7]。miRNA補充了RNA水平對靶mRNA分子的調(diào)節(jié),也是對RNA次要的中介角色的重要補充。因其對靶基因表達的多重調(diào)節(jié)，在各項生理病理過程中發(fā)揮重要作用，使得其功能及作用機制是近年來分子生物學研究的熱門，并且成為目前藥物研發(fā)的重要方向。miRNAs可存在于身體體液、血液及組織中，并且通過體液及血液的流動，在組織細胞間轉(zhuǎn)移流動，發(fā)揮其調(diào)節(jié)疾病病理、生理的作用。局部的病變可影響全身，全身的病變也可在局部得以體現(xiàn)，這充分體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀的理念。目前也有大量的實驗研究得以證實miRNA芯片技術(shù)用于中醫(yī)外治研究的可行性。例如Wang等[8]通過針刺治療自發(fā)性高血壓大鼠模型，發(fā)現(xiàn)miRNAs參與了高血壓大鼠對針刺治療的反應，針刺可對miR-339/Sirt2/NF-κB/FOX01的信號通路起到調(diào)節(jié)作用。端淑杰[9]通過新風膠囊聯(lián)合芙蓉膏對RA患者miRNA的基因譜分析研究，發(fā)現(xiàn)miR326與RA有一定關(guān)系，新風膠囊聯(lián)合芙蓉膏能明顯改善RA患者Th17/Treg信號通路，并通過臨床研究進行了進一步驗證。Liu等[10]以SAMP8小鼠為衰老模型，通過測序檢測電針刺激后CD4 T細胞miRNAs表達的變化, 表明電針有助于維持衰老免疫系統(tǒng)中CD4 T細胞分化的平衡，并進一步證實miR-301a-3p可介導C57BL/6J小鼠CD4 T細胞的分化，參與調(diào)節(jié)炎癥因子的表達。

3 水通道蛋白可作為中醫(yī)外治惡性胸水miRNA的切入點

近年來通過對惡性胸腔積液的大量研究表明，惡性胸腔積液的形成機制可以與以下幾種物質(zhì)相關(guān)：血管生成素-2[11]、白細胞介素(IL)-6[12]、幼稚B細胞[13]、TLR2信號[14]、EGFR-L858R表達[15]、水通道蛋白(aquaporins,AQPs)。其中AQPS是哺乳動物組織中多表達的跨膜水通道，廣泛分布于多種器官和組織的特定細胞類型中，在維持細胞體液平衡方面起著重要的作用。AQPs 家族中的 AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5目前研究均顯示與惡性胸腔積液具有相關(guān)性。

3.1中藥外敷最直接的作用途徑——AQP1在胸膜上的高表達 AQP1是跨膜水通道蛋白中最重要也是目前研究最多的水通道蛋白。在胸膜毛細血管的內(nèi)皮及間皮細胞上有豐富表達，并且進一步研證實大鼠臟層胸膜間皮細胞上AQP1的表達較壁層胸膜更加明顯[16]。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)：AQP1mRNA和VEGF蛋白的高表達與惡性胸腔積液的增加有關(guān)，提示AQP1和VEGF在小鼠惡性胸腔積液的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。許相范等[18]研究也指出非小細胞肺癌伴有胸水時其癌組織中TNF-α和VEGF高表達導致新生毛細血管增多, 導致胸腔內(nèi)滲出液不斷增多，但是新生血管大量出現(xiàn)時相應的AQP1并未同步增多，從側(cè)面證明癌性胸水與AQP1具有潛在聯(lián)系。Angelico等[19]研究發(fā)現(xiàn)AQP-1在惡性胸腔積液中表達高者的生存時間高于低表達者。因此，若以AQP1為治療靶點，就有可能促進積液的吸收。例如王兵等[20]采用中藥消水方對 Lewis 肺癌伴惡性胸腔積液的小鼠進行治療，證明中藥消水方可能通過下調(diào)壁層胸膜間皮細胞 AQP1 mRNA及蛋白表達，從而促進惡性胸腔積液的轉(zhuǎn)運，減少惡性胸腔積液的生成。王玨[21]采用瀉肺逐飲湯通過降低胸水和胸膜中AQP1的含量,關(guān)閉了促進腫瘤組織血管生成和腫瘤細胞快速擴增的通路,同時也阻斷了胸水產(chǎn)生的通道。張琦等[22]研究提示溫陽消飲法對胸腔積液大鼠的胸膜水通道蛋白AQP1表達具有明顯抑制作用。

3.2水液代謝失衡-AQPs在臟腑中的高表達 水液的代謝，與三焦的關(guān)系密切相關(guān)，在《圣濟總錄·痰飲通論》早有論述：“三焦者，水谷之道路，氣之所始終也。三焦通調(diào)……灌溉周身。若三焦氣塞，脈道雍閉，則水飲停積，不得宣行，聚成痰飲?！?所以全身水液代謝的正常，依賴于三焦正常的通利。上焦者乃肺臟，中焦乃脾臟與小腸，下焦腎臟與膀胱，各臟腑之間正常的氣化、傳輸，才能保證水液代謝的相對平衡，而胸水的形成乃是水液代謝失衡的表現(xiàn)。①肺主行水：肺為水之上源，當肺氣失宣，津液失于布散，則聚為痰飲，發(fā)于胸腔，形成胸水。目前研究亦證明，肺的水液代謝于呼吸道上水通道蛋白的分布有關(guān)，水通道家族的AQP1、AQP3、AQP4、AQP5共同參與調(diào)節(jié)了肺臟的水分子運動[23]。②小腸主液：小腸泌別清濁，是代謝水液吸收最主要的部位，是參與人體水液代謝的重要臟腑。若小腸吸收水液失常，水液可停具于胸中而導致胸水形成。目前研究也證明，小腸上的水通道蛋白的豐富表達是其參與水液吸收的重要機制。例如楊子慶等[24]通過研究發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯和葶藶大棗瀉肺湯作為溫陽消飲法的代表方治療胸腔積液的作用機制可能與上調(diào)小腸組織AQP4的表達有關(guān)。趙欣悅等[25]也亦證實溫陽消飲法可上調(diào)胸腔積液模型大鼠小腸AQP4的表達。③腎主水：腎為水臟，主水液的氣化，有蒸化水液、分清別濁的職責。肺主行水，腎主水，所以腎主水功能失常，則也會導致水飲停聚胸脅。AQP1、AQP2、AQP3均在腎臟組織中分布，而AQP2是腎臟集合管調(diào)節(jié)水液代謝的關(guān)鍵蛋白[26]。李思思等[27]通過研究溫陽消飲法消除胸腔積液與調(diào)節(jié)腎臟水通道蛋白表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)溫陽消飲法可上調(diào)胸腔積液大鼠腎臟AQP2表達，能夠明顯減少胸腔積液模型大鼠的胸腔積液量。李雷兵等[28]研究證實溫陽消飲法能有效減少大鼠胸腔積液量，而其上調(diào)胸腔積液模型大鼠腎組織AQP2的表達,可能是該法治療胸腔積液大鼠的部分作用機制。

3.3AQPS與miRNA的相關(guān)性 水通道蛋白和miRNA的相關(guān)性也是近年來分子生物學的熱門研究，雖然目前無明確及直接的對于胸水水通道蛋白的miRNA治療機制的研究，但是大量文獻表明，對影響惡性胸水關(guān)鍵的AQP1、AQP2、AQP3、AQP4等均發(fā)現(xiàn)相關(guān)的miRNA作用機制。①AQP1與miRNA：目前已證實的可調(diào)節(jié)AQP1表達的miRNAs包括miR-320a、miR-130a、miR-874等。Jiang等[29]發(fā)現(xiàn)MEF2C轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)了AQP1的表達，miR-133a-3p則抑制了AQP1的表達。miR-320a通過對IR后血脊髓屏障 AQP1的負調(diào)控，直接在功能上影響脊髓水腫[30]。②AQP2與miRNA：AQP2上存在大量的miRNA結(jié)合位點，梁春玲[31]對阿霉素腎病綜合征研究發(fā)現(xiàn)，真武湯可通過調(diào)節(jié)集合管miR-92b及AQP2表達,維持集合管細胞功能穩(wěn)定。③AQP3與miRNA:Su等[32]證明了人類長鏈非編碼RNA (lncRNA) H19可能作為一種競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)，通過對miR-874的競爭來調(diào)節(jié)AQP3的表達，從而在維持腸道屏障功能中發(fā)揮重要作用。microRNA-874被證明是PDAC細胞中AQP3表達的關(guān)鍵調(diào)控因子[33]。④AQP4與miRNA: miR-93的降低通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，減輕了ICH大鼠的神經(jīng)功能和腦水腫，抑制了神經(jīng)元凋亡[34]。LNA(TM) anti-miR-130a可上調(diào)AQP4 M1轉(zhuǎn)錄，減少腦梗死，促進康復[35]。miR-29b通過下調(diào)AQP-4降低缺血性卒中后血腦屏障的破壞[8]。另還有研究發(fā)現(xiàn)miRNA 290和miRNA 494可下調(diào)AQP4[36]。⑤AQP5與miRNA：外泌體共表達AQP5-靶向miRNA和IL - 4受體結(jié)合肽抑制人類乳腺癌細胞的遷移[37]。miR-96和miR-330均可調(diào)控AQP5的表達在脂多糖誘導的大鼠DIC中參與了肺水腫，可能成為分子治療的潛在靶點[38]。

4 結(jié) 語

綜上所述，中藥外敷在惡性胸水治療中具有一定作用，其中醫(yī)治療機制仍基于“利水”原則，而AQPs在調(diào)節(jié)人體水液代謝方面起著重要作用。因AQPs在胸膜上及影響水液代謝各組織中的豐富表達，可將其作為切入點，再結(jié)合目前論證藥效的中醫(yī)外治miRNA芯片技術(shù)及AQPs與miRNA的潛在關(guān)聯(lián)，進行相關(guān)miRNAs表達譜篩選工作，從基因?qū)用嫒ソ沂局兴幫夥笾委煇盒孕厮淖饔脵C制，并可深入研究，對相關(guān)靶基因進行進一步預測及驗證，最終可構(gòu)建出中藥外敷治療惡性胸水效應的miRNA-靶基因分子調(diào)控通路，為臨床應用提供較為可靠的科學依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。