從活血通絡(luò)法探討川芎嗪抗肝纖維化的作用機(jī)制研究進(jìn)展

潘富珍 劉 定

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江哈爾濱 150040

肝纖維化是由于各種致病因子長(zhǎng)期刺激，如酒精中毒、代謝異常、病毒、自身免疫反應(yīng)、膽汁淤積等。在肝損傷過程中，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）激活，產(chǎn)生過量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），其生成大于降解。如果持續(xù)肝損傷就會(huì)發(fā)展成纖維化，甚至肝硬化和肝癌。肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是HSCs 活化[1]。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)中藥中提取的一些單體具有延緩肝纖維化進(jìn)展，甚至逆轉(zhuǎn)，有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1]。川芎是活血類藥物，入肝經(jīng)，有活血化瘀、行氣之功效。川芎嗪是川芎根莖提取的有效成分，為吡嗪類生物堿。可顯著改善患者肝功能，同時(shí)降低肝纖維化中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，透明質(zhì)酸和層粘連蛋白，降低肝組織中丙二醛含量，還具有抑制成纖維細(xì)胞分裂、增殖的作用，從而達(dá)到防治肝纖維化的目的[2]。本文對(duì)近年川芎嗪治療肝纖維化機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下：

1 活血通絡(luò)理論在肝纖維化治療中的臨床應(yīng)用

肝纖維化基本病機(jī)屬于正虛血瘀，正虛為肝、脾、腎虧虛，血瘀證貫穿肝纖維化始終，且肝纖維化與血瘀程度密切相關(guān)，應(yīng)用活血化瘀通絡(luò)之法，以改善機(jī)體肝內(nèi)氣滯血瘀的狀態(tài)[3]。若各種病因?qū)е赂问栊?，日久可引起肝血瘀滯，而瘀血?nèi)阻，蘊(yùn)結(jié)于肝，必然損其肝體，阻其肝用，加重肝血瘀滯，形成肝纖維化過程中的病理基礎(chǔ)。《醫(yī)學(xué)發(fā)明·五邪相干》中記載：“血者，皆肝之所主，惡血必歸于肝?！苯沂玖损鲅c肝的重要關(guān)系。川芎入肝經(jīng)，屬于血中之氣藥，能上行頭目，下調(diào)經(jīng)水，中開郁結(jié)，旁通脈絡(luò)，活血行氣，發(fā)揮活血通絡(luò)功效。川芎嗪具有活血化瘀、抗血小板凝聚、直接清除具有細(xì)胞毒性作用的自由基、擴(kuò)張小動(dòng)脈、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、改善微循環(huán)、抗脂質(zhì)過氧化及拮抗臟器纖維化等作用[2]。

2 川芎嗪抗肝纖維化作用機(jī)制

2.1 參與誘導(dǎo)活化HSCs 凋亡

HSCs 已成為維持正常肝臟穩(wěn)態(tài)和生長(zhǎng)的主要調(diào)節(jié)因子，也是導(dǎo)致肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。誘導(dǎo)活化的HSCs 發(fā)生凋亡有助于肝纖維化逆轉(zhuǎn)。川芎嗪能夠抑制HSCs 增殖，通過抑制ERK 通路并活化p53 蛋白表達(dá)，增強(qiáng)p21 和p27 蛋白效應(yīng)。降低Fas/FasL 細(xì)胞因子的表達(dá)，阻斷肝細(xì)胞凋亡，引起HSCs 發(fā)生線粒體凋亡。HSCs 細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，還可以降低線粒體膜電位，上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)釋放Cytc，最終由凋亡蛋白酶caspases 執(zhí)行促進(jìn)HSCs 細(xì)胞凋亡[4]。

2.2 參與抑制細(xì)胞因子

ECM 由基底膜樣基質(zhì)向間質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)變，這些基質(zhì)蛋白共同激活原本處于靜息狀態(tài)的HSCs，導(dǎo)致ECM過度分泌，進(jìn)一步激活HSCs，形成正反饋環(huán)。HSCs 活化相關(guān)細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（con nective tissue growth factor，CTGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。下調(diào)這些因子能夠有效抑制HSCs 活化，阻止過度合成ECM，發(fā)生抗肝纖維化作用。

2.2.1 TGF-β1 TGF-β 細(xì)胞因子有30 多種，肝纖維化與TGF-β1 最相關(guān)。Smad 蛋白家族是其下游介質(zhì)。肝臟長(zhǎng)期受損時(shí)，TGF-β1 與其受體TGFβ-R 結(jié)合，導(dǎo)致Smad2 和Smad3 磷酸化，須與Smad4 結(jié)合轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，調(diào)控特定基因表達(dá)，激活信號(hào)通路，ECM 合成過多，引起肝纖維化。而胞漿中Smad6、Smad7 具有負(fù)性調(diào)控作用，拮抗TGF-β1 所介導(dǎo)的肝纖維化[5]。川芎嗪通過阻斷TGF-β1 細(xì)胞因子下游介導(dǎo)通路，抑制Smad2/3 的表達(dá)，提高Smad7 的水平，從而阻止肝纖維化的進(jìn)展[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，試驗(yàn)組用川芎嗪聯(lián)合γ干擾素治療乙肝型肝纖維化，肝纖維化標(biāo)志物、TGF-β1、Smad2/3/4 下降明顯優(yōu)于對(duì)照組（單獨(dú)使用γ 干擾素）。

2.2.2 PDGF PDGF 屬于血清衍生成分的一種，促進(jìn)HSCs發(fā)生高效有絲分裂，有PDGF A、B、C、D 四個(gè)基因產(chǎn)物，構(gòu)成4 個(gè)同源二聚體和1 個(gè)PDGF-AB 異源二聚體。這些生長(zhǎng)因子通過與其功能受體PDGFRα/α、β/β、α/β 結(jié)合，激活受體蛋白酪氨酸激酶中兩個(gè)基因編碼PDGFRA 和PDGFRB 來(lái)調(diào)節(jié)其作用，是對(duì)HSCs 有潛在趨化作用的細(xì)胞因子。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損害時(shí)，過度釋放PDGF，作用于HSCs 膜上相應(yīng)受體，激活特異性信號(hào)因子而參與免疫應(yīng)答[8]。川芎嗪阻止過氧化氫活化的HSCs 增殖。其機(jī)制是川芎嗪降低大鼠PDGFβR 表達(dá)量，PDGF-βR 下游的ERK 磷酸化和p38 通路作用受到阻斷?？赡芘c川芎嗪降低肝纖維化標(biāo)志物基因表達(dá)，以及調(diào)控參與HSCs 活化和ECM 內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)至關(guān)重要的蛋白有關(guān)[9]。

2.2.3 CTGF CTGF 能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、黏附、血管生成以及組織纖維化。其作為TGF-β 下游介質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期從G1晚期進(jìn)入S 期。激活細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，增加成纖維細(xì)胞增殖及強(qiáng)烈趨化作用。引起細(xì)胞發(fā)生增殖并沉積，促進(jìn)釋放過度ECM 及積聚，同時(shí)還能有效防止ECM 降解[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，川芎嗪可能通過下調(diào)CTGF，阻斷合成Ⅰ型膠原，發(fā)揮抗肝纖維化。川芎嗪抑制HSCs 增殖而改變其周期。此外還可降低HSCs-T6 細(xì)胞Bcl-2、CTGF 的表達(dá)，增加Bax，從而有效抗纖維化。通過降低CTGF 和Smad2/3 的表達(dá)，呈劑量和時(shí)間依賴性抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的HSCs-T6 細(xì)胞的增殖，拮抗肝纖維化[12]。

2.2.4 VEGF VEGF 屬于多功能蛋白中一種，與其受體VEGF-R1 和VEGF-R2 相結(jié)合。屬于目前最強(qiáng)烈的促血管生成調(diào)控因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和調(diào)節(jié)血管滲透性，以及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移[13]。肝纖維化與形成肝內(nèi)新生血管息息相關(guān)，VEGF 是重要的促血管形成的生長(zhǎng)因子，推動(dòng)肝纖維化。川芎嗪對(duì)肝臟的保護(hù)作用提供了新的視角，通過下調(diào)VEGF-A、VEGF-R2、PDGF-BB 和PDGF-βR 等4 種重要促血管生成因子，抑制血管生成[14]。

2.3 參與調(diào)控脂肪細(xì)胞因子

脂肪細(xì)胞因子來(lái)源于脂肪組織，在肝臟中傳遞動(dòng)態(tài)功能，參與調(diào)控機(jī)體穩(wěn)態(tài)，并參與調(diào)節(jié)肝纖維化或阻止肝纖維化。血漿中最豐富的脂肪因子脂聯(lián)素，除了在脂質(zhì)和糖代謝方面存在作用外，還具有抗炎反應(yīng)和肝保護(hù)作用，通過多種機(jī)制阻止肝纖維化發(fā)展。脂聯(lián)素與其受體結(jié)合后產(chǎn)生信號(hào)，對(duì)各種肝病起保護(hù)作用。瘦素由脂肪組織產(chǎn)生，影響肝內(nèi)胰島素信號(hào)通路，增加肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量，最終引起肝細(xì)胞變性，促進(jìn)HSCs 分化，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生[15]。

2.3.1 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）抑制劑 肝組織內(nèi)ECM 降解由MMPs 介導(dǎo)，相應(yīng)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）則妨礙其活性。纖維化的程度取決于MMPs 與TIMPs 間的平衡。改變MMP-1 與TIMP-1 比值，抑制TIMP-1 表達(dá)，阻止HSCs 增殖和遷移，可預(yù)防肝纖維化發(fā)生[15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，川芎嗪減少膠原和透明質(zhì)酸，通過增加MMP-13 表達(dá)，作用于HSCs，有效調(diào)節(jié)ECM 發(fā)生降解，由于上調(diào)MMP-13/TIMP-1 比例，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)肝纖維化作用。

2.3.2 瘦素 瘦素是促進(jìn)HSCs 活化的因子，HSCs 被激活后反過來(lái)產(chǎn)生更多瘦素，此正反惡性循環(huán)，使TGFβ1 也隨之增加，引起肝纖維化。主要是JAK/STAT 通路被激活，導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子STAT3 活化后，促進(jìn)形成ECM，進(jìn)而誘發(fā)肝纖維化[17]。鹽酸川芎嗪中有效成分川芎嗪能夠降低血清中TIMP-1 及瘦素水平，阻斷HSCs 活化，發(fā)揮抗纖維化的作用[18]。研究顯示[19]，川芎嗪抑制瘦素誘導(dǎo)的JAK1/STAT3 信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致α-SMA 和Ⅰ型膠原的減少，從而阻礙HSCs 活化，拮抗肝纖維化。

2.4 參與調(diào)控炎癥因子

炎癥反應(yīng)屬于纖維化的始發(fā)階段，肝細(xì)胞受損時(shí)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)HSCs 活化。白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）屬于抗炎因子中一種，抗肝纖維化。IL-1 促進(jìn)HSCs 活化，并導(dǎo)致生成MMP-13、TIMP-1 和MMP-9，發(fā)生肝纖維化。IL-17 也可激活HSCs，產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白，還可以刺激庫(kù)普弗（Kupffer cells，KCs）細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)釋放IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎癥因子，導(dǎo)致肝纖維化[20]。研究顯示[21]，川芎嗪對(duì)于刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠起到抑制作用，其機(jī)制是下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α，上調(diào)IL-10。川芎嗪減輕肝纖維化，通過降低TNF-α、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和IL-1β 水平，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟免受四氯化碳所致纖維化[22]。

2.5 參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激是指有氧代謝產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）/活性氮（reactive nitrogen species，RNS）與抗氧化系統(tǒng)清除能力之間的平衡失調(diào)。ROS/RNS 激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 信號(hào)，提高IL-6、IL-1β 促炎因子表達(dá)；炎癥細(xì)胞活化后，反過來(lái)又促進(jìn)ROS/RNS 產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激水平。ROS 也可激活核因子相關(guān)因子2（nuclear factor related factor 2，Nrf2）、TGFβ、NF-κB 等相關(guān)信號(hào)分子及其下游信號(hào)通路，調(diào)控肝纖維化。肝損傷后，HSCs 被細(xì)胞因子和KCs 釋放的ROS 激活，導(dǎo)致HSCs 增殖、合成和分泌ECM[23]。研究顯示[24]，川芎嗪顯著增強(qiáng)HSCs 中Nrf2 的表達(dá)和核移位，其抗肝纖維化機(jī)制是阻斷Nrf2/β-catenin 通路，對(duì)HSCs 行為的負(fù)調(diào)控。川芎嗪聯(lián)合丹皮酚在體內(nèi)外均有明顯抗肝纖維化作用。這可能是由于HSCs 線粒體功能破壞，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥和抑制ECM 形成與沉積[25]。

2.6 調(diào)節(jié)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（hepatic sinusoidal endothelial cells，LSEC）位于肝臟Disse 間隙內(nèi)，其特異結(jié)構(gòu)是具有篩選屏障的窗孔和基底膜。肝纖維化出現(xiàn)肝竇毛細(xì)血管化，失窗孔、連續(xù)基底膜以及HSCs 活化。HSCs 活化和肝纖維化中LSEC 發(fā)揮關(guān)鍵作用，正常分化的LSEC能夠使活化的HSCs 逆轉(zhuǎn)至靜息狀態(tài)，抑制肝纖維化進(jìn)展。肝損傷時(shí)，LSEC 成為促炎癥因子，同時(shí)分泌一系列細(xì)胞和趨化因子，加速肝臟炎癥反應(yīng)以及免疫功能發(fā)生改變[26]。研究發(fā)現(xiàn)[27]，川芎嗪能抑制典型Hedgehog，抑制體外培養(yǎng)HSCs 血管生成，改善小鼠肝纖維化和肝竇血管生成；還改善HIF-1α，抑制Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)，阻止肝竇性血管生成。此外，川芎嗪抑制四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型中LSEC 毛細(xì)血管化[28]。

2.7 自噬與肝纖維化

自噬對(duì)于肝纖維化具有雙重作用，一方面肝纖維化發(fā)生通過HSCs 活化，是由于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；通過自噬降解脂滴供應(yīng)HSCs 活化所需的能量以及自我更新。另一方面抗纖維化作用，肝細(xì)胞自噬不僅降低肝細(xì)胞死亡，而且通過調(diào)控巨噬細(xì)胞抑制炎癥因子釋放[29]。動(dòng)物研究顯示[30]，川芎嗪最佳濃度為25 ng/mL 時(shí)能夠刺激大鼠HSCs-T6 的自噬溶酶體，加速自噬溶酶體降解，削弱自噬，阻止肝纖維化持續(xù)進(jìn)展。川芎嗪能明顯減輕肝纖維化，調(diào)控免疫系統(tǒng)的不平衡，降低ECM 積聚以及肝纖維化中的自噬信號(hào)，抑制AKT-mTOR 信號(hào)通路[22]。

3 問題與展望

綜上所述，肝纖維化形成具有復(fù)雜的病因及發(fā)病機(jī)制。包含多種細(xì)胞因子、炎癥以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其病理基礎(chǔ)是瘀血阻絡(luò)，基本病機(jī)屬于氣滯血瘀，瘀血阻絡(luò)?；局委煼椒榛钛ńj(luò)。中藥川芎為血中之氣藥，氣血同治，氣行則血行，為肝纖維化活血化瘀的常用藥物。川芎嗪為川芎中主要有效成分。綜合近年研究，發(fā)現(xiàn)川芎嗪能通過調(diào)控TGF-β1、PDGF、VEGF 和CTGF 多種細(xì)胞因子，抑制HSCs 活化；誘導(dǎo)活化的HSCs 凋亡；調(diào)控脂肪細(xì)胞因子、肝臟炎癥反應(yīng)；抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、自噬等發(fā)揮抗肝纖維化作用，減緩肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展，甚至能夠有效逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的肝纖維化。但是，目前針對(duì)川芎嗪抗肝纖維化研究多局限于單一信號(hào)通路或肝纖維化相關(guān)因子影響方面，對(duì)細(xì)胞自噬、外泌體、免疫調(diào)節(jié)方面研究較少。基于自噬與免疫調(diào)節(jié)在肝纖維化中的重要作用，將進(jìn)一步研究中醫(yī)藥在免疫調(diào)節(jié)方面作用，為闡明中醫(yī)藥抗肝纖維化作用機(jī)制提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。