circRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在非小細胞肺癌診斷、預(yù)后及治療抵抗中的研究進展

黃家偉，黃 丹，李麗霞，楊志雄（1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 540；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東湛江 54001；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東湛江 54001）

肺癌是起源于氣管、支氣管黏膜或者腺體的一種惡性腫瘤，分為兩個組織學(xué)類型：非小細胞肺癌(NSCLC,占肺癌的85%)和小細胞肺癌(SCLC)。遺傳及環(huán)境因素的共同作用被認為是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的關(guān)鍵。肺癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，診斷時多為晚期(ⅢB-Ⅳ期)[1]。根據(jù)2020 年全球癌癥數(shù)據(jù)，肺癌仍然是癌癥死亡的首要原因，約占死亡病例的18.0%[2]。晚期肺癌預(yù)后差，治療手段有限且經(jīng)濟負擔(dān)重[3]。因此深入了解肺癌發(fā)生的分子機制，將有助于為其治療提供新的方案。人類基因組中編碼基因僅占2%[4]，剩余的基因大部分為非編碼RNA(ncRNA)[5]。研究者在ncRNA 的基礎(chǔ)上提出了競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)假說，mRNA、偽基因和lncRNA((Long non-coding RNA)可以通過與microRNA 響應(yīng)元件(MRE)結(jié)合相互調(diào)節(jié)[5]。隨后的研究亦發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA(circRNA)也是ceRNA 的一員[6]。本綜述介紹了ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中circRNA-miRNA-mRNA 在NSCLC 診斷、治療及預(yù)后中的作用。

1 circRNA和miRNA

circRNA 屬于非編碼RNA，于1976 年在RNA 病毒中被首次發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)其同樣存在于真核細胞中，并一直被認為是內(nèi)源性RNA 剪接錯誤的產(chǎn)物[6]。circRNA 和線性mRNA 都是通過剪接前體mRNA(pre-mRNA)產(chǎn)生的，與線性mRNA 使用的典型剪接不同，circRNA 主要通過反向剪接并共價連接3’上游剪接位點和5’下游剪接位點從而形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)。因此相較于線性RNA，circRNA 對核糖核酸酶(RNase)具有更高的抵抗力，也具有更長的半衰期及更高的穩(wěn)定性[6]。根據(jù)circRNA 的剪接形成模式和組成可以分為9 種類型，其中以外顯子circRNA(Exonic circRNA)、外顯子-內(nèi)含子circRNA(EIciRNA)和內(nèi)含子circRNA(ciRNA)最具代表性[7]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)circRNA 能特異性結(jié)合miRNA，參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[8]。

miRNA也是一種非編碼RNA。人類基因組中包含大量的miRNA 基因，是數(shù)量最多的小RNA，約占所有人類基因的15%，其中已被注釋的有2 000 個[9]。大部分miRNA 首先通過RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為初級miRNA(pri-miRNA)，在細胞核中被RNase ⅢDrosha進一步切割成前體miRNA (pre-miRNA)，最后經(jīng)由Exportin 5 轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)并由Dicer 切割形成雙鏈miRNA(dsRNA)。成熟的miRNA被裝載到Argonaute蛋白后，促進了RISC 的組裝，隨后與其靶基因的mRNA 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)特異性結(jié)合，起著負調(diào)控作用[10]。在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，1 個miRNA 可以調(diào)控多個mRNA，而1 個mRNA 也可以接受不同的miRNA 調(diào)控。據(jù)估計，約三分之二的人類編碼基因受miRNA調(diào)控[9]。

2 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在NSCLC中的作用

根據(jù)ceRNA 假說，當(dāng)circRNA 與miRNA 具有結(jié)合位點時可發(fā)生競爭性結(jié)合，發(fā)揮海綿作用，從而影響miRNA 對靶基因的調(diào)控作用。circRNA-miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在多種腫瘤中的作用已有較多的研究報道。在NSCLC中，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了腫瘤生存、侵襲遷移、耐藥等多種生物過程。

2.1 circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)在NSCLC 診斷和預(yù)后中的應(yīng)用

circRNA 是一種閉環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA，對RNase 具有抵抗力，同時這種穩(wěn)定性使它具有參與疾病診斷的潛力[6]。Zhang等[11]在NSCLC組織及細胞系中發(fā)現(xiàn)circ-SATB2 高表達，而circSATB2 可通過海綿miR-326 上調(diào)靶基因FSCN1(Fascin Actin-Bundling Protein 1)的表達，以促進細胞增殖、遷移和入侵。此外circSATB2還可以通過外泌體參與細胞間傳遞并影響受體細胞的功能。在另一項研究中，Liu 等[12]根據(jù)肺癌組織中circ_0046264 表達水平進行生存分析發(fā)現(xiàn)，低表達組患者的生存期明顯長于circ_0046264 高表達組。在患者的腫瘤組織和血清中，circ_0046264 的者操作特性(ROC)曲線下面積分別為0.971 和0.915，特異性為0.973和0.957，敏感性為0.951和0.927，約登指數(shù)分別為0.924 和0.884。此外，Tan 等[13]發(fā)現(xiàn)F-circEA 是由EML4-ALK(EMAP Like 4-ALK Receptor Tyrosine Kinase)融合基因反向剪切產(chǎn)生，并且特異地存在于EML4-ALK 陽性NSCLC 患者血漿中。上述這些研究表明circRNA 可在外周血循環(huán)中穩(wěn)定存在并具有進行檢測的可能性，而且它在NSCLC 組織及外周循環(huán)中具有相近的診斷效率，以及良好的特異性和敏感性，具有一定的實際應(yīng)用價值。另外，外周特定circRNA 的出現(xiàn)及表達變化還可反映腫瘤細胞內(nèi)相應(yīng)基因的改變，這將有助于疾病的診斷及治療。

circRNA 的表達水平變化也與NSCLC 的臨床預(yù)后相關(guān)。circ_0021205 在NSCLC 組織及細胞系中表達上調(diào)，并與腫瘤大小、淋巴結(jié)擴散和遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。在體外研究中發(fā)現(xiàn)circ_0021205通過海綿miRNA-16-5p 上調(diào)VEGFA(vascular endothelial growth factor A)表達水平以促進NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。Chen 等[15]通過在線微陣列數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)circ_100395 在NSCLC 中低表達，并在69 對肺癌組織和非腫瘤組織中得到進一步驗證。circ_100395 表達水平與腫瘤的TNM(腫瘤大小、淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移)分期及預(yù)后呈負相關(guān)。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，circ_100395 可以通過調(diào)節(jié)miR-1228/TCF21(transcription factor 21)信號軸抑制NSCLC 細胞的生存和侵襲遷移，并在異位移植實驗中得到驗證。Han等[16]發(fā)現(xiàn)circ-BANP的高表達與肺癌患者的低存活率相關(guān)，在機制上circ-BANP介導(dǎo)miR-503/LARP1(La Ribonucleoprotein Domain Family Member 1)信號軸促進NSCLC 細胞的生長和遷移。circ-FOXM1 和circ_0003645 也被發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中表達上調(diào)，并與淋巴結(jié)擴散、較晚的TNM 分期及預(yù)后密切相關(guān)[17-18]。而circ-RAD23B 則與腫瘤低分化和總生存期(OS)較短密切相關(guān)[19]。上述的研究表明circRNA 與NSCLC 的腫瘤大小、淋巴結(jié)擴散、遠處器官轉(zhuǎn)移、低分化程度及生存期直接關(guān)聯(lián)，這些都是NSCLC不良預(yù)后的獨立因素，同時也說明了circRNA在NSCLC中可能是一種潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

2.2 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)與NSCLC的治療

在肺癌的治療中，放療和化療是基本的治療手段，另外免疫及靶向治療也占據(jù)重要地位。一旦患者出現(xiàn)治療藥物耐藥及放射抵抗，都將導(dǎo)致患者預(yù)后變差。此外，患者出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移也被認為是治療失敗的原因之一。

順鉑、紫杉醇等化療藥物已經(jīng)作為NSCLC 指南中的一級推薦用藥，一旦腫瘤對這些藥物產(chǎn)生耐藥將有可能導(dǎo)致治療失敗[20]。Li 等[21]發(fā)現(xiàn)NSCLC 組織和細胞中的circ_0072083 表達升高，對其敲低后細胞的生存和轉(zhuǎn)移都受到抑制，而這一現(xiàn)象隨著順鉑的加入變得更顯著。機制研究發(fā)現(xiàn)，circ_0072083 通過海綿miR-545-3p 上調(diào)CBLL1(Cbl Proto-Oncogene Like 1)的表達，降低DDP對細胞的毒性作用。Guo等[22]則報道了circ_0011292調(diào)節(jié)miR-379-5p/TRIM65(Tripartite Motif Containing 65)信號軸促進NSCLC 對紫杉醇產(chǎn)生耐藥。另外，circPVT1 被報道在肺腺癌(LAD)組織中高表達，并與患者的淋巴擴散和化療藥物抵抗(順鉑和培美曲塞)呈正相關(guān)，機制上circPVT1 可以通過miR-145-5p/ABCC1(ATP Binding Cassette Subfamily C Member 1)信號軸促進LAD對順鉑和培美曲塞的耐藥[23]。Xiao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_103762在NSCLC組織和細胞中表達上調(diào)，并通過抑制CHOP(DNA Damage Inducible Transcript 3)的表達介導(dǎo)NSCLC 細胞的多重耐藥。

此外放射治療是NSCLC 的另一種基礎(chǔ)治療手段。Zhang 等[25]報道了circ_0001287 在NSCLC 組織和細胞系中表達下調(diào)，并與NSCLC 的分化程度和淋巴結(jié)擴散負相關(guān)。機制研究發(fā)現(xiàn)，circ_0001287 可以通過海綿miR-21 上調(diào)PTEN(Phosphatase And Tensin Homolog)的表達，進而抑制NSCLC 細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和放射抗性。Li 等[26]發(fā)現(xiàn)，circMTDH.4/miR-630/AEG-1(Astrocyte Elevated Gene-1 Protein)信號軸可以增強NSCLC 細胞對放射的抵抗性。circ_0086720 也被報道可以通過調(diào)控miR-375/SPIN1(Spindlin 1)信號軸增強NSCLC細胞的放射抗性[27]。Jin等[28]對獲得性抗輻射的A549和固有抗輻射的H1299細胞進行高通量測序，通過數(shù)據(jù)篩選和生物信息學(xué)方法構(gòu)建了一個包含14 個交互配對和8 個circRNA、4 個miRNA和4 個mRNA 的circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)，提供了一種潛在的篩選放療敏感性生物標(biāo)志物的策略。

腫瘤還可以通過免疫逃避而使人類的免疫系統(tǒng)無法有效識別清除腫瘤細胞。PD-1(programmed cell death 1)是一種免疫抑制分子，可被誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T 細胞，在平衡保護性免疫和免疫病理、內(nèi)穩(wěn)態(tài)和耐受力方面起著重要作用。然而，在對慢性病原體和腫瘤的反應(yīng)中，PD1 表達可以限制保護性免疫力[29]。現(xiàn)有研究表明抗PD-1 可以重新激活CD8+T 細胞的抗腫瘤作用[30]。Xu 等[31]研 究 發(fā) 現(xiàn)，circMET/miR-145-5p/CXCL3(C-X-C Motif Chemokine Ligand 3)信號軸參與了NSCLC 的免疫逃避。在NSCLC 組織中circMET 或CXCL3 表達和CD8+T 細胞之間呈負相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)circCPA4 和PD-L1(programmed cell death-Ligand 1)在NSCLC 細胞和癌組織中高表達，并且circ-CPA4 可以通過let-7 miRNA/PD-L1信號軸介導(dǎo)腫瘤免疫微環(huán)境中CD8+T 細胞的滅活[32]。circNDUFB2 也被發(fā)現(xiàn)在NSCLC 中通過激活RIG-I-mavs 信號級聯(lián)，招募免疫細胞進入腫瘤微環(huán)境(TME)以激活抗腫瘤免疫系統(tǒng)。而circFGFR1 可以通過海綿上調(diào)miR-381-3p 靶基因CXCR4(C-X-C Motif Chemokine Receptor 4)的表達，從而導(dǎo)致NSCLC 對PD-1 治療的耐藥[33]。在NSCLC的靶向治療中，Zhou 等[34]發(fā)現(xiàn)circ_0004015 可顯著增加HCC827 細胞對吉非替尼的耐藥性。Ma 等[35]也發(fā)現(xiàn)circ_0002130 可以通過靶向miR-498 調(diào)節(jié)GLUT1(Solute Carrier Family 2 Member 1)、HK2(Hexokinase 2)和LDHA (Lactate Dehy-drogenase A)，最終導(dǎo)致奧希替尼耐藥的發(fā)生。

在腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時，由鈣離子依賴的細胞粘附素家族(Cadherin)介導(dǎo)的細胞間粘附喪失以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族介導(dǎo)的細胞外基質(zhì)(ECM)降解都在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wei 等[36]發(fā)現(xiàn)circPTPRA 在NSCLC 腫瘤組織中表達顯著下降，并且其低表達水平與遠處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。circPTPRA 可以通過調(diào)控miR-96-5p/RASSF8 (Ras Association Domain Family Member 8)/E-cadherin 信號軸抑制NSCLC細胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。另一項研究發(fā)現(xiàn)circCAMK2A 在肺腺癌組織中高表達，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、晚期臨床階段和預(yù)后不佳密切相關(guān)；同時觀察到circCAMK2A 可以通過海綿調(diào)控miR-615-5p/fibronectin 1 信號軸，從而促進MMP2 和MMP9的表達，以及肺腺癌的轉(zhuǎn)移[37]。

3 小結(jié)與展望

近年來隨著技術(shù)的發(fā)展，circRNA 被重新認識并重視起來。令人驚喜的是，circRNA 的閉環(huán)結(jié)構(gòu)可以使它穩(wěn)定存在于腫瘤組織和外周循環(huán)中，或可提供一種損傷更小、更快捷、準(zhǔn)確的早期診斷策略，同時也可作為預(yù)后及指導(dǎo)治療的生物標(biāo)志物。肺癌除了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療等治療手段外，還有新興的靶向和免疫治療，這讓肺癌患者擁有了更多的治療選擇[38-39]。然而當(dāng)NSCLC患者出現(xiàn)治療抵抗或者遠處轉(zhuǎn)移等不良因素時，這些治療方法所取得的效果不顯著，并最終導(dǎo)致治療失敗和疾病進展。因此，不斷探索NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展機制以及探索新的治療靶點仍然是重要的。circRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了NSCLC 的治療抵抗及轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展。這是一個龐大、復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，值得我們對其進行深入探究，闡明其對NSCLC 的致病機制，為患者帶來更多的治療希望。