視神經(jīng)脊髓炎相關(guān)性視神經(jīng)炎實驗?zāi)Ｐ偷慕⒓皯?yīng)用

韓夢雨，王志軍，金 明

?KEYWORDS:neuromyelitis optica; optic neuritis; animal experiment; cell experiment; experimental models

0引言

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種神經(jīng)眼科交叉、高發(fā)于亞裔人群、體液免疫主導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)星形膠質(zhì)細胞病，以視神經(jīng)炎(optic neuritis，ON)和急性橫貫性脊髓炎為典型臨床表現(xiàn)[1]。與NMO相關(guān)的特發(fā)性視神經(jīng)炎稱為NMO相關(guān)性視神經(jīng)炎(NMO-associated optic neuritis，NMO-ON)， NMO-ON患者很難從常規(guī)治療中獲益，多遺留不同程度的視神經(jīng)萎縮[2-3]?？顾ǖ赖鞍?抗體(aquaporin-4 immunoglobulin G，AQP4-IgG)的發(fā)現(xiàn)與確認使得NMO及NMO-ON在發(fā)病機制、診斷及治療上取得顯著的進步[4]。視神經(jīng)在NMO中的特殊敏感性提示有必要研究視神經(jīng)特異性NMO模型的發(fā)病機制和治療反應(yīng)。然而，目前廣泛應(yīng)用的NMO實驗?zāi)Ｐ褪墙⒃谝延械腁QP4-IgG致病作用基礎(chǔ)上，只能部分模擬NMO病變。尤其是缺乏關(guān)注NMO-ON本身病理改變和發(fā)病機制的研究。本文將論述近年來關(guān)于NMO-ON及NMO實驗?zāi)Ｐ偷难芯窟M展，期望為NMO-ON發(fā)病機制的深入了解及開發(fā)新型診斷和治療方法提供幫助。

1動物實驗?zāi)Ｐ?/h2>

1.1伴或不伴有炎癥介質(zhì)的AQP4-IgG誘導(dǎo)的動物模型人和嚙齒動物AQP4蛋白結(jié)構(gòu)相似，利用人AQP4-IgG建立了基于AQP4的NMO或NMO-ON嚙齒動物模型。但單一靜脈輸注或腹腔被動注射AQP4-IgG不足以產(chǎn)生NMO樣病變及臨床特征[5]，主要是因為AQP4-IgG無法通過完整的血-腦屏障(blood-brain barrier，BBB)進入CNS，故早期該類模型的建立多采用破壞或繞過BBB和在CNS產(chǎn)生抗原特異性T細胞的策略。如AQP4-IgG經(jīng)完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)處理后，可破壞BBB，即可在部分大鼠體內(nèi)產(chǎn)生NMO樣致病作用[6]。其它炎癥介質(zhì)如趨化因子(如CXCL2)和促炎性細胞因子(如白細胞介素-6和干擾素-γ等)在紋狀體中的立體定向注射可誘導(dǎo)CNS炎性前狀態(tài)，促進AQP4-IgG進入注射半球并在注射部位附近誘發(fā)NMO樣病變。該模型為研究單個細胞因子或趨化因子在NMO和NMO-ON大鼠模型中損傷起始和演變中的作用提供了機會[6-7]。Sagan等[8]則論述了AQP4特異性T細胞誘導(dǎo)小鼠癱瘓及視覺系統(tǒng)損傷模型的詳細構(gòu)建過程及其意義。

此外，以實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)為基礎(chǔ)，采用AQP4-IgG系統(tǒng)注射法構(gòu)建了大鼠主動和被動NMO/EAE模型[7，9]，該模型原理為利用EAE破壞BBB并營造CNS炎性環(huán)境，隨后注射AQP4-IgG。不同點在于主動NMO/EAE模型將AQP4-IgG腹腔注射到預(yù)先用CFA乳化的牛髓鞘堿性蛋白免疫的大鼠[9]；被動NMO/EAE則將在體外抗原活化產(chǎn)生的反應(yīng)性T細胞再輸注正常大鼠，接著腹腔注射AQP4-IgG[9]。如腹腔注射純化的人AQP4-IgG或桿狀病毒表達法產(chǎn)生的高親和力抗AQP4單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)，可導(dǎo)致EAE模型Lewis大鼠視交叉、脊髓和腦干出現(xiàn)嚴重的NMO-ON和NMO樣病變[10]。Jones等[11]則利用此類NMO大鼠模型證明了CXCR2抑制劑可阻斷EAE時中性粒細胞向脊髓的遷移，但對該模型的炎癥或AQP4損傷沒有明顯的減輕作用。受限于大鼠、AQP4-IgG需求量大、實驗結(jié)果易受EAE本身病理變化影響和脊髓內(nèi)的病變呈現(xiàn)離散的小斑片狀等是NMO/EAE模型的缺陷。因此，與以往在EAE基礎(chǔ)上構(gòu)建的模型不同，Yick等[12]使用細菌預(yù)處理的小鼠腹腔注射高劑量(4mg/d，8d，每只小鼠32mg/d)AQP4-IgG，也成功構(gòu)造出AQP4-IgG誘發(fā)的補體無關(guān)的脊髓病變，包括星形細胞病變、神經(jīng)炎癥、脫髓鞘和軸突損傷/丟失。Lee等[13]在小鼠L5～L6鞘內(nèi)注射AQP4-IgG和補體，構(gòu)建NMO/EAE小鼠新模型，模擬NMO患者臨床表現(xiàn)與病理改變之間的關(guān)聯(lián)性。

另一種NMO或NMO-ON動物模型的構(gòu)造方式則是在大鼠鞘膜內(nèi)或者腦內(nèi)局部注射AQP4-IgG，不需要人補體及炎癥前狀態(tài)且避開BBB的屏障作用。如Lewis大鼠反復(fù)鞘膜內(nèi)注射人AQP4-IgG，可建立緩解復(fù)發(fā)NMO病變的過程[14]。將純化的AQP4-IgG慢性注入大鼠腦脊液，也可導(dǎo)致脊髓和視神經(jīng)出現(xiàn)NMO和NMO-ON樣病變[15]。但重復(fù)性及誘發(fā)率低、實驗者操作技術(shù)要求高、AQP4-IgG需求量更大等限制了使用大鼠構(gòu)建此類模型。

1.2 AQP4-IgG和人補體共同誘導(dǎo)的動物模型與大鼠不同的是，AQP4-IgG并不能激活小鼠體內(nèi)本身活性較低的補體系統(tǒng)，且小鼠血清對經(jīng)典補體系統(tǒng)的激活具有天然較強的抑制作用[16]，故人類補體的注入是建立此類小鼠模型的必要條件。該類實驗?zāi)Ｐ褪沟脽o炎癥前狀態(tài)的AQP4-IgG介導(dǎo)的發(fā)病機制中補體激活的研究和臨床前治療方法的測試成為可能。在缺乏T細胞的裸鼠腦內(nèi)注射AQP4-IgG和人的補體也能產(chǎn)生和野生型鼠相類似的NMO病灶，提示本模型不需要T細胞參與[17]。利用該類實驗?zāi)Ｐ妥C明了中性粒細胞[18]及抗體依賴性細胞毒性[19]在NMO或NMO-ON發(fā)病過程中的關(guān)鍵病理作用。Zhu等[20]利用腦內(nèi)AQP4-IgG和人補體注射構(gòu)建的小鼠NMO模型證明補體C5特異性單鏈抗體C5B3中和補體激活途徑中的C5，預(yù)防AQP4和星形膠質(zhì)細胞的丟失，減少脫髓鞘、炎癥浸潤和膜攻擊復(fù)合物的形成。Zhang等[21]利用同類方法構(gòu)建的NMO大鼠模型證明C16肽聯(lián)合血管生成素-1可通過改善炎癥環(huán)境來減輕NMO動物模型的進行性失明和癱瘓。

Matsumoto等[22]將AQP4-IgG陽性患者血清直接注射到SD大鼠的視神經(jīng)鞘內(nèi)，首次建立了NMO-ON模型。該類模型的病變局限于ON，排除其它病灶的干擾，為探討NMO-ON的作用機制和評價其潛在的治療作用提供了有價值的實驗?zāi)Ｐ?。如CD59敲除鼠視神經(jīng)病理改變明顯加重，提示補體調(diào)節(jié)因子在NMO-ON模型中的重要作用[16]。受此類研究方法影響，近期也有學(xué)者將AQP4-IgG陽性血清注入大鼠視神經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔，構(gòu)建一種視神經(jīng)和視覺功能缺陷的NMO-ON模型，首次對活體NMO-ON動物模型的視覺功能和視神經(jīng)變化進行縱向研究，創(chuàng)新性地用以探討視神經(jīng)結(jié)構(gòu)及視功能的進行性變化[23]。

1.3 AQP4-IgG陰性轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立

1.3.1 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠模型用AQP4胞外環(huán)免疫的致病性AQP4反應(yīng)性T細胞建立小鼠AQP4-IgG血清陰性NMO模型。AQP4特異性T細胞分化為Th17表型，轉(zhuǎn)入野生型小鼠，即構(gòu)建特異性T細胞受體(T cell receptor，TCR)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，出現(xiàn)NMO樣表現(xiàn)，如尾肢無力，病理改變包括T細胞浸潤和在腦、脊髓和視神經(jīng)的脫髓鞘。因此，即使在沒有AQP4-IgG的情況下，AQP4反應(yīng)性T細胞在觸發(fā)小鼠NMO樣反應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用[24]。

1.3.2 MOG特異性BCR/TCR轉(zhuǎn)基因小鼠通過在C57BL/6基因背景下建立能在視神經(jīng)內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生炎癥的轉(zhuǎn)基因小鼠，在理解ON的免疫發(fā)病機制方面取得了顯著進展。Bettelli等[25]首先構(gòu)建少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(myelin oigodendrocyte glycoprotein-immunoglobulin G，MOG)特異性TCR轉(zhuǎn)基因鼠和特異性B細胞受體(B cell receptor，BCR)轉(zhuǎn)基因鼠雜交形成的雙轉(zhuǎn)基因的“2D2”小鼠模型，具備表達MOG35-55的TCR的T細胞大于98%、自發(fā)形成ON、模擬體內(nèi)B細胞和T細胞免疫應(yīng)答等特點，是目前研究NMO-ON免疫病理及視功能改變的熱點動物模型，該類模型能幫助認識出現(xiàn)NMO典型癥狀但AQP4-IgG血清陰性的NMO或NMO-ON患者致病性。該模型缺點是未發(fā)現(xiàn)血管周圍AQP4-IgG和補體成分的沉積、粒細胞浸潤等[24]，并且對于2D2小鼠視神經(jīng)的優(yōu)先靶向性還沒有令人滿意的答案。但該模型制備不受實驗室及操作者技術(shù)水平影響，模型成功率較高的優(yōu)勢。因此，雙MOG轉(zhuǎn)基因小鼠盡管不能完全復(fù)制NMO病理學(xué)特征，但其有助于了解抗原特異性B細胞在調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細胞致病性方面的功能[25]。與MOG特異性BCR和TCR雙轉(zhuǎn)基因小鼠相似，用AQP4特異性BCR和TCR轉(zhuǎn)基因小鼠建立AQP4-IgG陰性免疫鼠模型有助于闡明免疫介導(dǎo)的脫髓鞘發(fā)生機制。但只有60%的實驗動物表現(xiàn)出NMO樣病理特征，包括大腦、視神經(jīng)和脊髓的T細胞浸潤和脫髓鞘[24，26]?？傊?，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中檢測和操作視神經(jīng)的炎性脫髓鞘是神經(jīng)眼科免疫學(xué)研究的一個非常有價值的資源。

2離體組織實驗?zāi)Ｐ?/h2>

用含有NMO患者AQP4-IgG的血清或純化的AQP4-IgG等處理體外培養(yǎng)的鼠脊髓、視神經(jīng)或海馬切片，可構(gòu)建NMO的離體組織或器官模型，用于NMO或NMO-ON的病理機制研究或治療藥物篩選。第一個離體NMO器官模型是由Verkman的小組構(gòu)建的[27]，在該模型中，橫斷脊髓切片在多孔的跨孔支架上培養(yǎng)數(shù)天，當(dāng)切片暴露于帶有補體的AQP4-IgG中1～3d時，會發(fā)生NMO樣病變。這類模型的主要局限性在于不能提供有關(guān)該疾病全身效應(yīng)的信息及不能評估BBB在NMO發(fā)病中的作用。然而，其具有NMO和NMO-ON的其他病理特征[6]，如視神經(jīng)或視網(wǎng)膜培養(yǎng)物暴露于AQP4-IgG和補體可導(dǎo)致視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中AQP4和GFAP的表達顯著減少[28-30]，這種病理過程可明顯地被溶酶體酸化或內(nèi)吞抑制劑阻止。因此，AQP4-IgG被動轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜病理改變是不依賴于補體的[29]。Tradtrantip等[31]則利用NMO脊髓切片模型證明重組IgG1-Fc六聚體對NMO病理形成過程中的預(yù)防作用。

3細胞實驗?zāi)Ｐ?/h2>

細胞實驗?zāi)Ｐ椭饕糜谘芯炕贏QP4-IgG介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞病變，可用于篩選維持星形膠質(zhì)細胞存活、阻斷AQP4-IgG介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞表型改變和細胞死亡的藥物作用。構(gòu)建方式包括從不同組織直接獲取星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)或用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建能穩(wěn)定表達不同AQP4的細胞模型。Kinoshita等[32]首次證明，NMO患者血清中AQP4-IgG通過經(jīng)典的補體依賴途徑誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細胞壞死，為模擬在NMO發(fā)展過程中自身抗體介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞的丟失提供了細胞模型。Sun等[33]開發(fā)了一種穩(wěn)定表達人M23-AQP4的中國倉鼠肺成纖維V79細胞的NMO治療藥物的高通量篩選模型，用于鑒定AQP4-IgG和AQP4結(jié)合的小分子抑制劑，并提出中藥成分異粉防己堿通過阻斷AQP4-IgG與AQP4的結(jié)合降低NMO星形膠質(zhì)細胞的細胞毒性。Hinson等[34]報道AQP4及其連接的谷氨酸轉(zhuǎn)運體-2的內(nèi)化需要AQP4-IgG與AQP4和星形膠質(zhì)細胞Fcγ受體結(jié)合，該實驗結(jié)果為開發(fā)治療NMO或NMO-ON的新藥物提供了上游靶點證據(jù)。近年來也開發(fā)出抑制補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)的細胞模型[31]。由于AQP4-IgG能識別NMO中AQP4的胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domains，ECDs)，因此用抗AQP4的mAbs也建立了小鼠NMO細胞模型。桿狀病毒表達法可產(chǎn)生兩個抗AQP4-mAbs，稱為E5415A(識別M1和M23 AQP4亞型)和E5415B(僅識別M23亞型)。E5415A通過增強星形膠質(zhì)細胞表面AQP4簇形成所觸發(fā)的M1和M23的內(nèi)吞作用誘導(dǎo)表達AQP4的星形膠質(zhì)細胞降解，而E5415B的損傷明顯減輕。這項研究表明，抗AQP4-ECD抗體能夠交聯(lián)多個AQP4陣列，形成一個AQP4大簇，導(dǎo)致AQP4內(nèi)吞和溶酶體降解[35]。

4結(jié)語

本文從細胞、離體組織及動物等不同層面論述了NMO及NMO-ON的實驗?zāi)Ｐ偷慕⒓皯?yīng)用，相關(guān)實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建已為NMO-ON和NMO相關(guān)的發(fā)病機制、開發(fā)有效治療等方面做出重大貢獻。但復(fù)雜的病理學(xué)和視覺系統(tǒng)的特殊性導(dǎo)致了難治性NMO-ON及其實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建。因此，在NMO實驗?zāi)Ｐ突A(chǔ)上開發(fā)更特異性、能直接評價活體動物的視功能和視神經(jīng)形態(tài)的NMO-ON實驗?zāi)Ｐ托枰M一步的研究。期望本文能為未來NMO和NMO-ON的發(fā)病機制、診斷及治療等研究提供幫助。