紅樹莓提取物通過TGF-β1/Smad信號通路改善大鼠酒精性肝纖維化

李彤 李紅靈 胡浩 謝曉君 葉莉娜 蘭梅

(1.貴州省人民醫(yī)院內(nèi)鏡中心，貴州 貴陽 550002；2.首鋼水鋼總醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 六盤水 553000)

肝臟纖維化是肝臟內(nèi)一系列纖維組織增生的病理反應(yīng)，引起肝纖維化的原因多種多樣，當(dāng)前影響最大最普遍的因素是酒精，如果不立即實(shí)施相關(guān)方案來預(yù)防和治療肝纖維化疾病，肝組織的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)被嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致肝硬化，對人類造成巨大的生命威脅[1]。由酒精因素引起的肝硬化稱之為酒精性肝病(ALD)，即長時(shí)間飲過量的酒會(huì)導(dǎo)致肝臟組織損傷，發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)。胡睿報(bào)道[2]目前可以通過抑制肝臟中星狀細(xì)胞活化和弱化肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的沉積來達(dá)到控制酒精性肝病的目的。而這兩者可以通過中草藥及其提取物調(diào)控酒精性肝病的相關(guān)通路來實(shí)現(xiàn)。有研究[3]報(bào)道與酒精性肝纖維化疾病聯(lián)系最為緊密的通路是TGF-β1-Smad 通路。吳建良[4]研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草及其提取物可以改善酒精性大鼠的肝纖維化疾病，其機(jī)制是冬蟲夏草及其提取物中的多酚類物質(zhì)下調(diào)TGF-β1/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。紅樹莓為薔薇科漿果，因其富含各種基本營養(yǎng)成分和有藥理功能的活性化合物，在世界上享有“黃金水果”的聲譽(yù)[5]。研究[6]表明紅樹莓提取物中富集大量的多酚類抗氧化物質(zhì)，并且與冬蟲夏草有著同樣的功能，即對于肝纖維化具有保護(hù)作用。然而，到目前為止，對于紅樹莓提取物是否能緩解肝纖維化損傷的機(jī)制研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建酒精性肝纖維大鼠模型，用紅樹莓提取物來治療酒精性肝纖維大鼠，觀察大鼠肝臟組織的病理變化、血清生化指標(biāo)及TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化，以期首次揭示紅樹莓提取物緩解酒精性肝纖維化損傷的作用機(jī)制，為后續(xù)天然藥物抗肝纖維化理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 健康且為SPF級的SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2試驗(yàn)藥物、試劑與儀器 試驗(yàn)藥物：紅樹莓提取物由本試驗(yàn)制備；安琺特購自黑龍江江世藥業(yè)有限公司。試驗(yàn)試劑：谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測試盒和總膽固醇(TC)測試盒購自南京建成科技有限公司；Masson三色染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；RIPA裂解液購自上海貝博生物科技有限公司蛋白26616 Marker(Thermo Fisher，美國)；PVDF膜(Merck Millipore，德國)；蛋白抗體TGF-β1和Smad7購自美國Proteintech有限公司。試驗(yàn)儀器：Leica RM2016 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)；OlympusBX5型光學(xué)顯微鏡；梅特勒臺式pH；TS-1000水平搖床；高速臺式離心機(jī)；YT-6生物組織烘烤機(jī)；EPS 300型電泳儀；微量移液器；UV-1800型紫外分光光度計(jì)等。

1.3方法

1.3.1建立酒精肝纖維化大鼠模型及分組給藥 60只SD雄性大鼠適應(yīng)性正常飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組、紅樹莓低濃度組、紅樹莓中濃度組、紅樹莓高濃度組和安琺特組。其中空白組：不作任何處理，正常環(huán)境下飼養(yǎng)的大鼠，在開始灌胃給藥后，給大鼠灌服等量蒸餾水，1次/d，持續(xù)4周；模型組：每天對大鼠灌胃5%乙醇8 g/kg，連續(xù)灌胃12周，酒精性肝纖維化模構(gòu)建成功后，給大鼠灌服等量蒸餾水，1次/d，持續(xù)4周；紅樹莓低、中、高濃度組是在造模成功后每天分別灌服0.05 g/kg、0.125 g/kg和0.259 g/kg的紅樹莓提取物，1次/d，持續(xù)給藥4周；安琺特組在造模成功后每天灌服21.6 mg/kg的安琺特陽性藥，持續(xù)給藥4周。末次給藥后處死所有大鼠并采集血液和肝臟組織用于后續(xù)分析檢測。

1.3.2指標(biāo)檢測 肝臟組織病理學(xué)檢測：待肝臟組織分離后，取一部分組織放入福爾馬林溶液中進(jìn)行固定備用，帶到實(shí)驗(yàn)室之后參照胡睿[2]所述方法對肝臟組織進(jìn)行HE染色和Masson 染色，觀察大鼠肝臟組織纖維化的程度及變化。血清生化指標(biāo)檢測：血清分離之后嚴(yán)格按照試劑盒說明書來檢測大鼠血清中ALT、AST、TC的活性。蛋白表達(dá)水平檢測：用Western-blotting 法檢測各組大鼠肝組織中TGF-β1和Smad7的蛋白表達(dá)水平，具體操作參照陳永欣等人所述方法進(jìn)行[7]。

2 結(jié) 果

2.1紅樹莓提取物對酒精性肝纖維大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示，空白組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常、大小均勻，可見細(xì)胞核，匯管區(qū)無纖維結(jié)締組織增生及炎性細(xì)胞浸潤；模型組中肝組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死，可見脂肪變性，匯管區(qū)及中央靜脈區(qū)纖維結(jié)締組織增生及炎性細(xì)胞浸潤；給藥后，紅樹莓低、中、高濃度組和安琺特組中肝組織破壞程度降低，肝細(xì)胞變性程度減輕，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生及炎性細(xì)胞浸潤減少，見圖1。Masson染色結(jié)果顯示，空白組中匯管區(qū)僅有少量膠原沉積；模型組中在匯管區(qū)、中央靜脈區(qū)及肝細(xì)胞間均存在大量的膠原沉積；與模型組比較，紅樹莓低、中、高濃度組和安琺特組中膠原沉積顯著減少，且紅樹莓濃度越高，膠原沉積越少，見圖2。

2.2紅樹莓提取物對酒精性肝纖維大鼠血清中ALT 、AST和TC含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中中ALT、AST和TC水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，紅樹莓低、中、高濃度組和安琺特組中ALT、AST和TC水平顯著降低(P<0.05)，且具有紅樹莓濃度依賴性。見圖3。

2.3紅樹莓提取物對酒精性肝纖維大鼠肝臟組織中TGF-β1和Smad7蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織中TGF-β1的蛋白水平顯著升高(p<0.05)，Smad7蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，紅樹莓低、中、高濃度組和安琺特組中TGF-β1的蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Smad7蛋白水平顯著升高(p<0.05)，且具有紅樹莓濃度依賴性。見圖4。

3 討 論

肝纖維化疾病是肝臟組織受損傷的慢性過程，其致病機(jī)理受到多種信號通路中細(xì)胞因子、抑制因子以及靶細(xì)胞的調(diào)控[8]。而酒精性肝纖維化疾病的致病機(jī)理是由于乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛對肝臟產(chǎn)生慢性并且持續(xù)性的損傷，導(dǎo)致肝臟纖維組織異常增生和肝臟細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，有研究表明這個(gè)致病過程具有可逆的特征[9]。因此，治療酒精性肝纖維化疾病具有重大而深遠(yuǎn)的意義。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過構(gòu)建酒精性肝纖維大鼠模型，用紅樹莓提取物來治療酒精性肝纖維大鼠，結(jié)果觀察到紅樹莓提取物能緩解大鼠肝臟組織的破壞程度、減少肝組織膠原沉積，提示紅樹莓提取物能有效的改善酒精性肝纖維化大鼠肝組織損傷。

趙杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)人類長時(shí)間飲酒會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的促、抗氧化物的水平發(fā)生明顯的變化，進(jìn)而逐漸損傷肝臟細(xì)胞。當(dāng)肝臟細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞間通透性會(huì)顯著增加，細(xì)胞中大量的酶會(huì)從胞內(nèi)穿梭到血液，使得血液中主要的酶ALT，AST和TC 水平快速增加，因此，血液中這三種酶濃度的多少可以反映出肝臟受到損傷的程度，通常也作為肝臟損傷的標(biāo)志性指標(biāo)[11]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)紅樹莓提取物能降低酒精性肝纖維化大鼠血清中ALT、AST和TC的含量，且具有紅樹莓濃度依賴性。以上結(jié)果表明紅樹莓提取物對酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。TGF-β1，即轉(zhuǎn)化生長因子β1，它是一種功能多樣的細(xì)胞因子，曹力波等[12]研究表明TGF-β1與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積存在著緊密的聯(lián)系。同時(shí)閆冰等[13]指出TGF-β1是肝臟受到損傷后最主要最關(guān)鍵的促肝纖維化因子。TGF-β1可以促進(jìn)肝臟星狀細(xì)胞活化和增殖[14]。徐旭東等[15]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1通過與受體結(jié)合參與所有肝纖維化病理過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。謝雷[16]研究發(fā)現(xiàn)Smad信號蛋白是細(xì)胞內(nèi)目前確定的唯一的TGF-β受體。根據(jù)報(bào)道[17]Smad信號蛋白共有8種，Smad1～ Smad8，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同可分為3種類型：特異型、共同型和抑制型，抑制型包括Smad6和Smad7。研究[18-19]表明抑制型蛋白Smad7在TGF-β1信號傳導(dǎo)過程中參與負(fù)反饋調(diào)控，被公認(rèn)為是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑。其原因是Smad7和受體調(diào)節(jié)型蛋白R-samd的結(jié)構(gòu)比較相似，能夠更有效更快的與Ⅰ型受體結(jié)合，從而阻止受體對R-samd的憐酸化，最終阻斷信號傳導(dǎo)來進(jìn)行調(diào)控[20]。在本研究中，酒精性肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1蛋白顯著升高，Smad7蛋白顯著降低。在進(jìn)行紅樹莓提取物組和陽性藥安琺特處理后，肝臟組織組中TGF-β1的蛋白水平顯著降低，Smad7蛋白水平顯著升高，且具有紅樹莓濃度依賴性。以上結(jié)果表明，紅樹莓提取物能夠降低酒精性肝纖維大鼠肝臟中TGF-β1和Smad7的蛋白水平，從而改善肝纖維化疾病損傷。

紅樹莓提取物可以有效防治酒精性肝纖維化大鼠肝組織炎癥、壞死、出血以及纖維化程，緩解肝臟損害。同時(shí)，紅樹莓提取物能夠降低酒精性肝纖維化模型大鼠血清ALT、AST和TC的含量，進(jìn)而有效改善肝臟的功能。紅樹莓提取物還可以降低肝組織中 TGF-β1和Smad7的蛋白表達(dá)，說明紅樹莓提取物改善酒精性肝纖維的作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad7信號通路密切相關(guān)。但明確紅樹莓提取物改善酒精性肝纖維化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

(本文圖1～圖4見封三)