循環(huán)腫瘤DNA在惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后的研究進(jìn)展*

蔡一丹，易 帆 綜述，謝小兵 審校

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410208;2.湖南航天醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410205； 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗與病理中心，湖南長沙 410007

隨著人們生活水平提高和壽命的延長，癌癥成為威脅人類健康的主要疾病之一，腫瘤的檢測和治療也成為人類面臨的世界性醫(yī)學(xué)難題。已有的檢測方法有的檢出率較低，有的存在侵入性傷害，具有一定的局限性[1]。尋求一種非侵入性檢測方法，對惡性腫瘤進(jìn)行早期篩查、診斷以便早發(fā)現(xiàn)、早治療，是研究人員一直不斷努力的方向。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)分子檢測作為新一代體液活檢技術(shù)，由于具有微創(chuàng)、信息全、可重復(fù)性等優(yōu)勢，近年來受到腫瘤生物學(xué)和腫瘤臨床醫(yī)學(xué)工作者的重視。本文就近年來關(guān)于ctDNA的生物學(xué)特征、檢測方法及在常見惡性腫瘤臨床中的早期診斷、預(yù)后評估及用藥指導(dǎo)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ctDNA的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)特征

ctDNA是腫瘤患者血液中游離的來自腫瘤細(xì)胞的DNA。健康人體中均存在一類細(xì)胞游離DNA(cfDNA)，它們是可以存在于血液或其他體液中并游離于細(xì)胞之外。通常血液中的cfDNA主要由壞死和凋亡后的白細(xì)胞釋放入血液中，在某些疾病(如心肌梗死、冠心病)及特殊狀態(tài)下(如急性劇烈運動、妊娠)，其他細(xì)胞也會釋放cfDNA入血液。MANDEL等[2]于1948年首次報道了健康個體外周血中存在cfDNA。LEON等[3]1977年發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中cfDNA的水平顯著升高。10多年后，VASIOUKHIN等[4]和SORENSON等[5]相繼在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征和胰腺癌患者外周血cfDNA 中發(fā)現(xiàn)了ras基因的突變，科學(xué)工作者將從腫瘤細(xì)胞脫落釋放入體液中的一類cfDNA稱為ctDNA。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者無論其處于腫瘤進(jìn)展的哪個階段、何種類型的實體瘤均存在ctDNA水平的顯著升高，并證實隨著腫瘤的進(jìn)展，ctDNA的水平不斷升高[6-7]。然而，ctDNA釋放到血液中是隨機(jī)過程還是經(jīng)過某種特定生物學(xué)程序加工后再釋放，仍是腫瘤生物學(xué)中一個有爭論的課題[8]。

ctDNA中常包含有突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常及甲基化等相關(guān)DNA突變信息[9]。ctDNA片段一般為166 bp的核酸序列，其半衰期為16 min至2 h不等。由于血漿中存在核酸酶，單獨以DNA形式存在的ctDNA片段大多易被降解，ctDNA大多以DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式存在。健康人體在免疫系統(tǒng)特別是巨噬細(xì)胞的吞噬和溶酶體的清除作用下，血液中的ctDNA水平較低。腫瘤患者ctDNA水平顯著升高，一方面機(jī)體腫瘤細(xì)胞在以指數(shù)方式倍增，腫瘤細(xì)胞的代謝、凋亡和壞死的量及釋放進(jìn)入血液的循環(huán)腫瘤細(xì)胞也以同樣的方式倍增，循環(huán)腫瘤細(xì)胞播散及壞死釋放的DNA超出了機(jī)體正常的清除能力；另一方面，腫瘤患者機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能大多異常，導(dǎo)致腫瘤患者血液ctDNA顯著升高。有研究表明，健康人血液中cfDNA水平多為1～100 μg/L，而腫瘤患者血液中ctDNA 濃度可達(dá)1 000 μg/L，平均為180 μg/L[10]。

2 ctDNA的檢測方法

腫瘤是一種由于體細(xì)胞的基因異常產(chǎn)生的病變，這些突變的體細(xì)胞DNA，只存在于癌前細(xì)胞或癌細(xì)胞基因組中，同一機(jī)體的其他正常細(xì)胞基因組則不會出現(xiàn)，這保證了ctDNA 能以特有的生物特異性成為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。因此，理論上所有用于鑒定體細(xì)胞DNA變異的分子生物學(xué)技術(shù)都可以用于ctDNA的檢測。然而，由于體液中ctDNA水平非常低，通常ctDNA只有cfDNA的0.01%～1.00%，常規(guī)基因測序技術(shù)如Sanger法、焦磷酸測序只能用于高負(fù)荷腫瘤檢測或是高豐度ctDNA突變片段分析，使其推廣和臨床應(yīng)用受到了極大限制。近年來，隨著DNA 測序技術(shù)和分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展，對痕量DNA 分子進(jìn)行定量分析已經(jīng)有了多種選擇。當(dāng)前常用的可用于ctDNA檢測和分析技術(shù)有第二代的高通量測序法(NGS)、磁珠捕獲法(BEAMing)[11]、微滴式數(shù)字PCR技術(shù)[12](ddPCR)、低溫變性下復(fù)合PCR技術(shù)(cold-PCR)[13]。

2.1NGS NGS技術(shù)具有通量高、檢測速度快、成本較低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各種體液標(biāo)本DNA的分析。NGS主要包括DNA連接，DNA文庫構(gòu)建，克隆模板擴(kuò)增和大規(guī)模平行測序。NGS平臺可執(zhí)行大規(guī)模的DNA并行測序，以實現(xiàn)對來自樣品的數(shù)百萬個DNA片段進(jìn)行統(tǒng)一測序和對未知突變的篩查，并分析基因的遺傳多態(tài)性。NGS技術(shù)的應(yīng)用主要有兩個：一是進(jìn)行基因組靶序列捕獲測序，設(shè)計合適的芯片探針，可實現(xiàn)對一個或多個已知致病基因進(jìn)行測序；二是進(jìn)行全外顯子組測序或全基因組測序，前者可用于研究基因組的蛋白編碼區(qū)域，從而揭示對疾病和群體健康的遺傳影響，后者可對不同個體或者是群體進(jìn)行全基因組序列分析和生物信息學(xué)分析，可全面挖掘基因組的各類變異[14]。

2.2BEAMing BEAMing 技術(shù)是利用磁珠來吸附游離DNA，其探針是一條序列已知的單鏈固定在固相(芯片、微珠)表面，另一條樣品中的單鏈來與其雜交配對。它可以從數(shù)萬個正常細(xì)胞DNA中檢測出有基因突變的ctDNA 分子。GARCIA等[15]對183例已知EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者，分別采用BEAMing和NGS方法檢測患者ctDNA中T790M EGFR基因突變，檢測陽性率分別為21.8%和10.9%。

2.3ddPCR ddPCR技術(shù)是先將DNA鏈模板稀釋到單個模板分子并分配到大量獨立的反應(yīng)單元中，即先對標(biāo)本微滴化處理，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對每個獨立反應(yīng)室熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，最后定量DNA拷貝數(shù)。ddPCR不依賴擴(kuò)增的循環(huán)閾值(Ct)，不需內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好和絕對定量分析等優(yōu)點[16]。ddPCR和優(yōu)化的NGS在ctDNA分析中也各有優(yōu)缺點。與NGS相比，ddPCR實驗更容易建立，速度更快，敏感度更高，分析不需要復(fù)雜的信息學(xué)支持。BETTEGOWDA等[17]報道，采用ddPCR技術(shù)，超過80%的晚期結(jié)直腸癌、黑色素瘤和胰腺癌患者中可以檢測到血漿ctDNA中與癌癥相關(guān)的熱點基因突變。與此類似，VESSIES等[18]也在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌和胰腺癌中檢測到血漿ctDNA中相關(guān)基因的突變。

2.4cold-PCR cold-PCR技術(shù)是在高豐度野生型DNA片段背景下選擇性變性并擴(kuò)增低豐度突變型DNA片段序列的方法，cold-PCR技術(shù)可將突變型序列富集10～100倍。基于突變片段Tm值的改變和異源雙鏈DNA分子的形成，cold-PCR可富集擴(kuò)增片段中所有類型和位置的突變，也可富集未知突變，具有敏感高、特異性強、精確度高、低成本和易操作等優(yōu)點[19-20]。SEFRIOUI等[21]采用ddPCR技術(shù)和cold-PCR技術(shù)定量分析了29例結(jié)直腸癌患者血清ctDNA中Kras基因突變，發(fā)現(xiàn)cold-PCR可以準(zhǔn)確地檢測和量化ctDNA的低豐度基因突變，在保證定量分析準(zhǔn)確性的前提下可快速得出分析結(jié)果。

3 ctDNA在惡性腫瘤臨床應(yīng)用中的進(jìn)展

由于ctDNA中包含患者腫瘤的全部遺傳學(xué)信息，利用ctDNA做為腫瘤標(biāo)志物，分析其突變、缺失、插入、倒位及甲基化等表觀遺傳學(xué)改變，在腫瘤的早期篩查、預(yù)后以及用藥指導(dǎo)等各方面可以發(fā)揮重要作用。

3.1ctDNA作為惡性腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志 近年來，關(guān)于疾病生物標(biāo)志物的研究一直是臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點、重點和難點。特別是精準(zhǔn)醫(yī)療的概念提出后，腫瘤生物標(biāo)志物相關(guān)研究計劃被列入了國家“973”計劃、國家重點研發(fā)計劃、科技部重大專項計劃等[22]。這些生物標(biāo)志物是疾病復(fù)發(fā)、進(jìn)展或預(yù)后評估中的指示因子。來自腫瘤的ctDNA能在一定程度上代表腫瘤的整個基因組格局，并且可以用作液體活檢來分析腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學(xué)改變，包括癌基因或抑癌基因的突變、甲基化及基因擴(kuò)增等。在過去的幾年中，ctDNA作為有效且可靠的生物標(biāo)志，在對特定患者進(jìn)行分型，指導(dǎo)臨床早期診斷和治療及預(yù)后的評估中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。利用ctDNA生物標(biāo)志，早期檢測特定類型癌癥的表觀遺傳學(xué)異常，如癌基因或者抑癌基因中啟動子的低甲基化，可以為腫瘤生物學(xué)研究和臨床治療提供重要信息。多項研究表明，在肝癌患者外周血ctDNA中，常見TP53[23]、ITH[24]、HCK[25]和TNNB1[26]存在特異性突變，提示可以檢測患者外周血ctDNA來早期診斷肝細(xì)胞癌變。GORMALLY等[27]報道了檢測血漿ctDNA，最早可以提前2年發(fā)現(xiàn)健康受試者的Kras基因突變，提前在癌癥診斷之前的20.8個月發(fā)現(xiàn)健康患者TP53的突變。早期腫瘤或腫瘤微轉(zhuǎn)移的晚期患者雖然血漿中只含有較低豐度的ctDNA片段，但是隨著DNA檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，對痕量DNA定量定性分析也成為可能[28]。

3.2ctDNA在惡性腫瘤預(yù)后評估中的作用 臨床醫(yī)生根據(jù)影像和組織標(biāo)本檢測中得到的信息，結(jié)合臨床觀察、腫瘤進(jìn)展分期、組織病理學(xué)改變和生物分子特征等可以對不同癌癥患者的預(yù)后進(jìn)行評估。當(dāng)組織切片不易獲得(如非實體瘤)，或者保存的組織切片基因分析遇到困難，利用患者血液檢測ctDNA的重要性就得到顯現(xiàn)。BETTEGOWDA等[17]的研究表明，ctDNA 可在超過75% 的非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌及頭頸癌中檢測到。已有研究證明，ctDNA具有一系列與腫瘤相關(guān)的分子生物學(xué)特征：ras 基因及TP53基因的突變，p14、p16、APC基因過甲基化，等位基因雜合性缺失(LOH)及mtDNA 改變等現(xiàn)象[29]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中，大約1/3都有Kras基因突變，GAUTSCHI等[30]研究了180 例肺癌患者ctDNA 發(fā)現(xiàn)Kras突變與患者預(yù)后不良有關(guān)。PARKINSON 等[31]對40例惡性復(fù)發(fā)性高級別漿液性卵巢癌患者TP53基因ctDNA突變情況分析，顯示在化療1個療程后，TP53突變等位基因分?jǐn)?shù)下降>60%的患者有更長的無復(fù)發(fā)生存期。MORIKAWA等[32]對卵巢透明細(xì)胞癌患者血漿PIK3CA和Kras基因ctDNA檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞高水平PIK3CA-H1047R或KRAS-G12D 的ctDNA患者有更短的生存期。一系列的研究表明，胰腺癌患者血漿ctDNA含有Kras基因突變并且Kras基因的突變可以用來監(jiān)測胰腺癌的發(fā)展[33-34]。DABRITZ等[35]檢測了56例胰導(dǎo)管腺癌患者及13例胰腺炎患者血漿ctDNA中Kras基因突變，胰導(dǎo)管腺癌中檢測到20例患者的Kras基因有突變，而在胰腺炎患者中均無Kras基因的突變。在結(jié)腸直腸癌的研究方面，TROJAN等[36]比較了37例結(jié)直腸癌患者血液ctDNA中Kras基因突變及CDKN2A啟動子的超甲基化情況，發(fā)現(xiàn)Kras基因有突變和(或)CDKN2A啟動子有超甲基化的患者，其2年生存率為48%，而二者沒有發(fā)生改變的患者，其2年生存率為100%。

3.3ctDNA在惡性腫瘤治療中用藥指導(dǎo)作用 近年來，腫瘤藥物在傳統(tǒng)的放療、化療的藥物基礎(chǔ)上呈現(xiàn)多樣化、個性化和精準(zhǔn)化的趨勢，選擇安全、療效可靠的藥物是腫瘤臨床治療面臨的重要挑戰(zhàn)。作為一種生物標(biāo)志，患者外周血中ctDNA水平及不同類型腫瘤相關(guān)基因的變異特征都能有效反映腫瘤的變化，ctDNA檢測在腫瘤手術(shù)治療或者藥物治療后療效評估中顯示出了其誘人的應(yīng)用潛力。

有研究表明，晚期結(jié)直腸癌患者ctDNA檢測分析能反映腫瘤進(jìn)展?fàn)顩r及術(shù)后預(yù)后評估，也能指導(dǎo)靶向藥物的治療方案及尋找耐藥發(fā)生機(jī)制，通過檢測Kras基因野生型和突變型來研究晚期結(jié)腸癌EGFR 阻斷劑耐藥突變的出現(xiàn)[37]，對可能產(chǎn)生的耐藥位點基因突變進(jìn)行檢測，并追蹤耐藥突變基因。BETTEGOWDA等[17]對晚期結(jié)腸癌患者Kras、BRAF、NRAS、EGFR和PIK3CA的所有外顯子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)96%的晚期結(jié)腸癌患者的Kras或NRAS基因至少一個有突變。可見血漿ctDNA檢測對卵巢癌患者藥物選擇及藥物耐藥的預(yù)測能起到臨床用藥指導(dǎo)作用。

4 基于ctDNA檢測的腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療在臨床應(yīng)用中存在的問題和未來發(fā)展趨勢

4.1ctDNA檢測在腫瘤臨床應(yīng)用中存在的問題

4.1.1研究的樣本量有限，限制了ctDNA在臨床的廣泛應(yīng)用 盡管已有研究顯示，血漿ctDNA 與惡性腫瘤組織基因突變有高度一致性，但目前的研究大多處于實驗室研究階段，研究的樣本量較少，因此在惡性腫瘤患者中，血漿ctDNA檢測能否完全取代腫瘤組織的基因檢測從而進(jìn)一步指導(dǎo)臨床診斷、治療和用藥仍需進(jìn)一步的、前瞻性的臨床研究證實。

4.1.2檢測方法和觀察指標(biāo)的穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)化還需要進(jìn)一步提高 目前血漿ctDNA 檢測方法有多種實驗技術(shù)，各種惡性腫瘤血漿ctDNA檢測觀察指標(biāo)不一，各種監(jiān)測技術(shù)及觀察指標(biāo)如何更加敏感、穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)化地應(yīng)用于評估腫瘤發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，仍需大規(guī)模、大樣本的臨床研究驗證。

4.2ctDNA檢測技術(shù)在腫瘤臨床應(yīng)用中的發(fā)展趨勢 隨著腫瘤生物學(xué)、分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)研究的不斷深入，以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，ctDNA 在惡性腫瘤診療過程中的作用將不斷受到重視。ctDNA檢測的快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、侵害性小、實時動態(tài)佳等優(yōu)勢受到越來越多的科研工作者和臨床醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注。基于腫瘤患者血液ctDNA的監(jiān)測策略將更全面、動態(tài)地反映腫瘤進(jìn)展的演變過程，顯示腫瘤在早期診斷、預(yù)后、臨床用藥指導(dǎo)的價值。人類基因檢測技術(shù)的發(fā)展為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療提供了技術(shù)支撐。目前，基于NGS、BEAMing、ddPCR及cold-PCR技術(shù)等基因測量技術(shù)的發(fā)展，對基因的表達(dá)分析和檢測更加精準(zhǔn)，為腫瘤的分型和精準(zhǔn)治療提供了技術(shù)援助，隨著這些檢測技術(shù)的進(jìn)步和更新，檢測成本的不斷降低，對腫瘤精準(zhǔn)治療的實施將成為現(xiàn)實。