循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測與臨床應(yīng)用

王 萍 綜述，井豐軍 審校

蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，安徽蕪湖 241000

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指由實體腫瘤原發(fā)病灶中脫落出來，進(jìn)入血液循環(huán)和(或)淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞，具有與原發(fā)腫瘤相似的特征，能夠反映腫瘤發(fā)生發(fā)展情況并可能介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。近年來，CTCs的檢測技術(shù)得到飛速發(fā)展。隨著檢測技術(shù)的提高，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，CTCs在多種惡性腫瘤的診斷、治療、療效評估和預(yù)后方面有著重要作用。

1 CTCs的富集和檢測

1.1CTCs的富集 傳統(tǒng)的腫瘤檢測方法，是以組織活檢獲取病理標(biāo)本，以查找到腫瘤細(xì)胞為“金標(biāo)準(zhǔn)”，標(biāo)本獲取困難，患者創(chuàng)傷較大，而CTCs存在于患者血液中，獲取途徑?jīng)]有侵襲性，易于操作，是一種“液體活檢”。CTCs在外周血中數(shù)量極其稀少，因此，在檢測之前需要先對CTCs進(jìn)行富集。臨床常用的富集技術(shù)，主要基于兩方面：CTCs的物理特性或CTCs表面生物特征。

1.1.1基于CTCs的物理特性 根據(jù)大小、密度、電荷等方面差異將CTCs與正常的造血細(xì)胞區(qū)分開來。比如MCA系統(tǒng)根據(jù)CTCs與正常血液細(xì)胞在大小和變形能力上的差異，將CTCs特異性分離出來[1]。物理富集過程相對簡單，所需時間短，不依賴于CTCs特定表面標(biāo)志物，但部分白細(xì)胞大小性質(zhì)與CTCs相近，致使所獲得CTCs特異性和純度較低。

1.1.2基于CTCs表面生物特性 主要根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理。這種富集技術(shù)又分為正向富集：捕獲CTCs，洗脫健康血細(xì)胞；負(fù)向富集：捕獲非目標(biāo)細(xì)胞(即健康血細(xì)胞)，洗脫目標(biāo)細(xì)胞(即CTCs)。正向富集通常根據(jù)CTCs表達(dá)的上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)作為標(biāo)記物，在免疫磁珠系統(tǒng)通過與磁珠結(jié)合的抗體來捕獲抗原，然后，抗原-抗體復(fù)合物經(jīng)由磁場被分離出來。亦有依靠其他分子標(biāo)志物如人類表皮生長因子受體2(HER2)。隨著對腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體(FRs)認(rèn)識的增加，利用CTCs表面FRs檢測CTCs在肺癌中的應(yīng)用也逐漸增多[2]。目前唯一一個通過FDA認(rèn)證的CellSearchTM系統(tǒng)就是基于EpCAM技術(shù)，隨后問世的其他新的檢測方法多是與CellSearchTM進(jìn)行比較。然而CellSearchTM系統(tǒng)有著難以克服的缺點：(1) 設(shè)備昂貴；(2)每個樣本的檢測成本較高；(3)檢測過程需要復(fù)雜的富集步驟；(4)每個樣本檢測時間長；(5)捕獲的CTC純度很低；(6)假陽性和假陰性率都較高。因此，CellSearchTM系統(tǒng)很難被廣泛應(yīng)用。

負(fù)向富集CTC檢測技術(shù)的優(yōu)勢包括:(1)不依賴于CTCs的表面生物標(biāo)志物，可以有效避免CTCs表面抗原表達(dá)減弱或缺失導(dǎo)致的假陰性，具有普遍適用性；(2)可以完整的收集不同性質(zhì)的CTCs。缺點也很明顯：(1)所獲得 CTCs 純度較低；(2)得到的低純度CTCs的鑒定需要進(jìn)一步復(fù)雜的分析程序；(3)使用負(fù)向富集技術(shù)捕獲血細(xì)胞需要大量抗體，成本高。

上述富集技術(shù)都是在體外進(jìn)行富集，SAUCEDO-ZENI等[3]發(fā)現(xiàn)一種體內(nèi)富集技術(shù)，通過插入患者肘部靜脈的導(dǎo)絲，在非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌患者體內(nèi)獲得CTCs。體內(nèi)富集優(yōu)點：(1)相對于體外方法有限的血樣容量，體內(nèi)富集能得到更多的CTCs;(2)靈敏度要求較低，降低了技術(shù)門檻;(3)假陰性率低。缺點:(1)體內(nèi)富集時間較長;(2) CTCs捕獲需要大量抗體、成本高；(3)富集方法具有侵入性，患者較難以接受。

以上所有富集方式得到的CTCs都需要后續(xù)實驗進(jìn)行檢測鑒定，富集方式即使不同檢測方法可以相同。CTCs檢測方法很多，在蛋白水平上有流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)、免疫熒光染色、上皮細(xì)胞免疫斑點技術(shù)(EPISPOT)等；在基因水平上有熒光原位雜交、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈技術(shù)、基因測序等。

1.2CTCs的檢測

1.2.1FCM 可通過識別熒光抗體與CTCs結(jié)合后，產(chǎn)生的熒光信號來收集CTCs[4]。 優(yōu)點是定量檢測CTCs，而且可以對CTCs進(jìn)行后續(xù)分析。缺點在于靈敏度較差，可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，操作復(fù)雜，價格昂貴。

1.2.2免疫熒光染色 固定富集的細(xì)胞后,用抗CD45、角蛋白熒光抗體和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)等熒光染料標(biāo)記抗體，染色細(xì)胞，并用熒光顯微鏡進(jìn)行分析，這也是目前最常用的方法[5]。 其優(yōu)點是在熒光顯微鏡下觀察，更加方便，可觀測細(xì)胞蛋白表型及形態(tài)。缺點是蛋白標(biāo)志物的表達(dá)缺乏穩(wěn)定性，不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

1.2.3EPISPOT 它檢測單個上皮癌細(xì)胞分泌釋放的蛋白質(zhì)。該方法的原理是利用富集的CTCs在培養(yǎng)基中分泌特定蛋白質(zhì)，再使用熒光標(biāo)記的分泌蛋白抗體，與CTCs進(jìn)行孵育以使抗體與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，最后通過熒光顯微鏡觀察，定量檢測具有生物活性的CTCs[6]。一個單一的免疫斑點代表著一個活細(xì)胞，該方法具有高特異度和高穩(wěn)定性的顯著特點。但細(xì)胞培養(yǎng)需要有足夠數(shù)量的分泌標(biāo)記蛋白積累形成免疫斑點。

1.2.4熒光原位雜交 (FISH) FISH 技術(shù)通過標(biāo)記染色體能檢測到染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常的腫瘤細(xì)胞[7]。優(yōu)點是在基因水平鑒定CTCs，靈敏度和特異性更高；缺點是有可能受到來自于患者血液細(xì)胞中異常染色體干擾，且選擇一種染色體探針只能檢測對應(yīng)的一個標(biāo)志物。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 將腫瘤特異性mRNA序列反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過PCR技術(shù)擴增后識別腫瘤特異性mRNA的表達(dá)[8]，是目前檢測CTCs最常用的方法之一。但是由于PCR只是從基因?qū)用嫔翔b別CTCs，所以無活力的CTCs在此方法中同時被鑒定出來，在細(xì)胞變形性分析和藥物反應(yīng)測定方面，需要取活細(xì)胞，使得應(yīng)用受限。

1.2.6基因測序(NGS) 使用精確和高通量的下一代測序(NGS)技術(shù)，對CTCs進(jìn)行細(xì)胞測序，能在單個細(xì)胞水平上鑒定基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，對CTCs進(jìn)行基因分型，用于腫瘤的突變分析，有助于癌癥精準(zhǔn)醫(yī)療的建立[9]。NGS技術(shù)對上游分離技術(shù)要求很高，要求CTCs純度、豐度達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)。

富集檢測方法機制不同，各有優(yōu)缺點，單純一種方法很難分離出純的和有代表性的CTCs亞群。現(xiàn)在開發(fā)的技術(shù)方法多是將物理和生物特性聯(lián)合起來，進(jìn)行優(yōu)化[10]。

2 CTCs的臨床應(yīng)用

2.1CTCs在腫瘤早期診斷中的價值 DING等[11]的一項研究表明CTCs可作為篩查孤立性肺結(jié)節(jié)和早期肺癌的標(biāo)志物。聯(lián)合應(yīng)用CTCs和癌胚抗原(CEA)可顯著提高肺腺癌的檢出率。ZHOU等[2]也發(fā)現(xiàn)葉酸受體陽性的CTCs(FR+-CTCs)可以鑒別孤立肺結(jié)節(jié)的惡性程度，靈敏度為78.6%～82.7%，特異度為68.8%～78.4%。此外，F(xiàn)R+-CTC計數(shù)聯(lián)合最大腫瘤直徑 (MTD)可以區(qū)分非侵襲性癌癥和侵襲性癌癥，這為醫(yī)生的診斷提供了重要依據(jù)。而CTCs DNA(ctDNA)分析已被批準(zhǔn)用于表皮生長因子受體(EGFR)突變檢測轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌[12]。除肺癌外,CTCs在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的診斷和分期中有積極作用，4 mL血液中≥3個 CTCs值可用于區(qū)分局限性和轉(zhuǎn)移性PDAC，靈敏度為85.2%，特異度為86.7%[13]。檢測多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)的循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞，可對骨髓瘤復(fù)發(fā)起到一定監(jiān)測診斷作用[14]。在一項為期兩年的研究中，RIED 等[15]對542人進(jìn)行了CTCs檢測，其中一半人屬于癌癥高危人群，觀察發(fā)現(xiàn)在所有癌癥患者體內(nèi)均檢測到CTCs，比如多發(fā)性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，重要的是，在檢測到CTCs的男性中，有多達(dá)一半的人前列腺特異性抗原(PSA)水平正常，隨后通過前列腺特異膜抗原正電子發(fā)射體層顯像融合計算機體層顯像技術(shù)(PSMA-PET)掃描顯示陽性，診斷為早期前列腺癌，這表明CTCs在前列腺癌的篩查中，與PSA相比更可靠。通過CTCs篩查和隨后的掃描發(fā)現(xiàn)的其他類型的癌癥包括早期乳腺癌、卵巢癌等。

2.2CTCs在腫瘤治療中的應(yīng)用 有研究數(shù)據(jù)表明，帕唑帕尼治療的小細(xì)胞肺癌患者的CTCs計數(shù)和表型特征具有臨床相關(guān)性和預(yù)測價值。此外，分析CTCs在抗血管生成治療過程中的不同亞群可以作為監(jiān)測治療效果的動態(tài)生物標(biāo)志物[16]。在一組27例接受去勢手術(shù)的轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，CTCs評分的提高提示患者為高危人群，總體生存率較差，另一組34名局限性前列腺癌患者中，術(shù)前CTCs評分升高預(yù)測鏡下可能會出現(xiàn)精囊和(或)淋巴結(jié)播散，這些觀察結(jié)果提示CTCs分析有助于預(yù)測局限性前列腺癌接受手術(shù)切除的患者是否存在早期播散的可能性[17]。另153例結(jié)腸直腸癌(CRC)肝轉(zhuǎn)移患者中發(fā)現(xiàn)，CTCs DNA可作為液體活檢工具，有助于判斷患者是否需要接受肝切除手術(shù)[18]。在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)治療中,術(shù)前化療的作用仍存在爭議。ZHAO等[19]對所有入組患者進(jìn)行CTCs檢測，發(fā)現(xiàn)對于Ⅱ期或Ⅲ期ESCC患者，在任何治療之前CTCs檢測為陽性，術(shù)前化療可改善短期無進(jìn)展生存期(PFS)。在局部進(jìn)展性胃癌中，發(fā)現(xiàn)多西他賽/奧沙利鉑/5-FU (DOF)方案聯(lián)合貝伐珠單抗總有效率明顯高于DOF組，貝伐珠單抗的加入顯著提高了手術(shù)切除率和R0切除率(P<0.05)。用FISH法計數(shù)CTCs，DOF+貝伐珠單抗組新輔助治療后CTCs計數(shù)下降明顯大于DOF組(P=0.033 5)。這些有益作用可能與CTCs計數(shù)的減少有關(guān)[20]。

2.3CTCs在腫瘤預(yù)后判斷中的應(yīng)用 在小細(xì)胞肺癌中，60%的患者檢測到CTCs，與Ⅰ～Ⅱ期患者相比，Ⅲ期患者的CTCs計數(shù)呈非顯著增加趨勢，基線≥15個CTCs預(yù)測100%的患者生存期≤2年，70%的患者生存期≤1年[21]。一項對156例，新近診斷為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者(MBC)的研究中，使用CellSearchTM系統(tǒng)檢測基線(BL)和系統(tǒng)治療1、3、6個月后的CTCs和CTC簇，隨訪時間25(7～69)個月，發(fā)現(xiàn)基線時≥5個CTCs組與生存受損顯著相關(guān)，后續(xù)測量結(jié)果顯示，治療期間≥5個CTCs和有CTC簇的患者預(yù)后危險性增加。CTCs和CTC簇的縱向評估改善了開始一線系統(tǒng)治療的MBC患者的預(yù)后監(jiān)測。預(yù)后價值隨時間增加，提示CTCs計數(shù)的變化具有臨床相關(guān)性[22]。另一項對于乳腺癌的研究也顯示，無論原發(fā)腫瘤的大小、級別或淋巴結(jié)是否陽性，在原發(fā)腫瘤切除前確認(rèn)的一個或多個CTCs，預(yù)測更差的無復(fù)發(fā)生存率和總體生存率[23]。而在肝臟腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)，在影像學(xué)未顯示肉眼可見的微小門靜脈浸潤(mPVI)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之前，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)陽性的CTCs≥5為危險因素，可能是肝細(xì)胞癌(HCC)患者預(yù)后的一個有用的生物標(biāo)志物[24]。同時，有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量與多發(fā)性骨髓瘤(MM)治療反應(yīng)顯著相關(guān)[25]。

陳萬青等[26]報道我國惡性腫瘤發(fā)病第一位是肺癌，接下來依次為胃癌和肝癌，而女性發(fā)病第一位的是乳腺癌，在這些腫瘤中，都發(fā)現(xiàn)CTCs的重要作用。

3 存在的問題

CTCs檢測對患者創(chuàng)傷較小，可出現(xiàn)于病理學(xué)、影像學(xué)異常表現(xiàn)之前，且能反復(fù)獲取以便對腫瘤狀況進(jìn)行檢測，是近年來的熱點研究領(lǐng)域，但真正應(yīng)用于臨床還有諸多難點需要克服：(1)缺乏健全和標(biāo)準(zhǔn)化的檢測程序，CTCs來源于不同設(shè)備不同的檢測方法，而且沒有一個明確的參考范圍，使得結(jié)果解讀比較困難；(2)特異性較差，現(xiàn)在選擇的標(biāo)志物通常是上皮細(xì)胞來源，無法確定是哪個部位哪種腫瘤，即使找到CTCs，臨床醫(yī)生也難以判斷其來源，限制了CTCs在腫瘤早期篩查早期診斷中的應(yīng)用；(3)缺乏特異性CTCs標(biāo)志物，非上皮細(xì)胞來源的CTCs標(biāo)志物很少；(4)價格昂貴，無論哪種方法富集檢測CTCs，對絕大多數(shù)病患來說，都是個不小負(fù)擔(dān)。CTCs檢測方法眾多，需要了解各自原理，根據(jù)腫瘤類型和臨床需要選擇適宜方法。CTCs在實體瘤的作用仍需大規(guī)模的臨床實驗來驗證，但其為人們提供了對于癌癥研究的新思路。