內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腎臟纖維化中的作用

葛 婷，阮鴻嬌，李金堯，胡萬祥，陳志宏，宋成軍

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

腎臟纖維化（renal fibrosis，RF）主要表現(xiàn)為腎小管萎縮、腎小球硬化等特征，是所有慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎臟疾病的共同途徑。因此，了解導(dǎo)致RF的基本機制對于開發(fā)更好的慢性腎臟病治療方案至關(guān)重要。到目前為止，國內(nèi)外對RF的發(fā)生機制多集中于腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化、腎小管上皮細(xì)胞的損傷、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的穩(wěn)態(tài)和炎性細(xì)胞的浸潤等方面。最新研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）發(fā)生的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT）可能加速了RF，并被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞（myof ibroblast，MF）增殖的新機制。因此，本文就EndoMT在慢性RF中的研究進(jìn)展予以綜述，以期了解在RF過程中EndoMT所起的作用，為其治療提供新的見解和思路。

1 概述

在全球范圍內(nèi)，慢性腎臟病的發(fā)病率和患病率急劇增長，且預(yù)后差，是繼心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病之后又一嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。有統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，截至2016年，中國成人慢性腎臟病的粗患病率為13.4%[1]，其中45%的死亡可歸因于RF[2]。此外，Hoerger等[3]預(yù)測，2030年，美國30歲及以上人口中慢性腎臟病的患病人數(shù)將增至近3800萬，即患病率可能達(dá)到16.7%。當(dāng)慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎臟疾病時，除腎臟移植或透析外，目前尚無有效的治療手段。因此，慢性腎臟病已經(jīng)成為一個全球公共健康問題，且?guī)砹司揞~經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，亟需開發(fā)新的干預(yù)措施以減緩其發(fā)生和發(fā)展。

大量數(shù)據(jù)表明，RF是導(dǎo)致慢性腎臟病的主要決定因素，RF的病變程度與病情預(yù)后密切相關(guān)。在各種致病因素（炎癥、創(chuàng)傷、代謝紊亂、毒物、氧化應(yīng)激、外泌體等[4]）的作用下，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞、ECs、腎小管上皮細(xì)胞、骨髓來源的纖維細(xì)胞等都可轉(zhuǎn)化為MF，而MF則是產(chǎn)生ECM的主要效應(yīng)細(xì)胞，加速RF的進(jìn)程。其中，ECs轉(zhuǎn)化成MF即EndoMT現(xiàn)已成為國際腎臟病領(lǐng)域極其關(guān)注的研究熱點[5,6]。

2 ECs的功能

在腎臟微血管環(huán)境中，ECs的結(jié)構(gòu)高度不均一，從腎小球前小動脈到管周毛細(xì)血管床高度分化，除了具有典型的屏障作用以及構(gòu)成血管內(nèi)表面，在血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用外，還參與許多生理過程，包括血管舒縮張力的控制、抗凝和纖溶、血栓形成、組織炎癥反應(yīng)和血管重塑的調(diào)節(jié)[7]。由于ECs具有許多重要的功能，于是眾多科學(xué)家開始研究慢性腎臟病的發(fā)生是否與ECs的損傷相關(guān)。目前已證實腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（glomerular endothelial cells，GEnCs）的損傷確實參與了慢性腎臟病發(fā)生的多個病理過程，尤其與RF密切相關(guān)。

GEnCs是腎小球血管網(wǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，與足細(xì)胞及腎小球基底膜共同構(gòu)成腎小球的濾過屏障，作為第一道防線，能使大分子物質(zhì)不被濾過排出，在腎臟濾過功能中起關(guān)鍵作用。此外，GEnCs還可與足細(xì)胞和系膜細(xì)胞相互作用，并受到源自這些細(xì)胞的關(guān)鍵血管生成因子的調(diào)節(jié)。足細(xì)胞可產(chǎn)生血管生成因子，包括GEnCs生存所必需的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）；系膜細(xì)胞產(chǎn)生的血管生成素-2（Ang-2）也能到達(dá)GEnCs，調(diào)節(jié)其功能，并可能抵消Ang-1的促血管生成作用。而GEnCs自身也分泌許多血管活性因子，如內(nèi)皮素-1(ET-1)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)因子、一氧化氮合酶(NOS)等[8]。因此，上述各類血管生成因子的相互調(diào)節(jié)與平衡穩(wěn)定對GECs的影響不容忽視。

3 EndoMT促進(jìn)RF

3.1 EndoMT

EndoMT最初于胚胎發(fā)育期的心臟被發(fā)現(xiàn)，心內(nèi)膜細(xì)胞通過EndoMT作用轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞，最終形成房室墊、室間隔和瓣膜的原始形態(tài)[9]。ECs發(fā)生EndoMT時，會失去其內(nèi)皮標(biāo)記物，如CD31、血管內(nèi)皮鈣粘蛋白（VEcadherin）和Von-Willebrand因子，并獲得間充質(zhì)標(biāo)記物，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）和成纖維細(xì)胞特異蛋白（FSP-1），這種轉(zhuǎn)變最初由Eisenberg等[10]描述。此外，在EndoMT發(fā)生的過程中，ECs的形態(tài)特征性表現(xiàn)為緊密連接的喪失和極性改變，紡錘體形成，細(xì)胞增殖和遷移能力增強，從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架修飾和細(xì)胞連接重排，細(xì)胞形態(tài)也由鵝卵石樣向梭形纖維化樣轉(zhuǎn)變[11]。在分子表達(dá)改變和形態(tài)學(xué)改變的持續(xù)積累下，ECs最終會喪失內(nèi)皮表型而轉(zhuǎn)化為MF，促進(jìn)組織纖維化。在人機體內(nèi)，EndoMT不僅參與了胚胎時期心臟的發(fā)育，還參與了多種疾病的過程。在不同病理因素的作用下，相關(guān)器官會發(fā)生纖維化，如心肌纖維化、肺纖維化、肝纖維化、角膜纖維化、腸纖維化、傷口愈合和RF等[12，13]。同時，EndoMT在動脈粥樣硬化和腫瘤的進(jìn)展中也發(fā)揮著重要作用[14，15]。

3.2 RF

ECM轉(zhuǎn)換的病理失衡導(dǎo)致RF，此時MF的持續(xù)激活又導(dǎo)致ECM的過度沉積。纖維化時，ECM的病理性積聚增加了組織的硬度，從而進(jìn)一步激活MF，導(dǎo)致激活的正反饋回路和腎組織硬度增加。腎組織的結(jié)構(gòu)特征改變，會導(dǎo)致其順應(yīng)性降低，腎組織的功能受損[16]。RF的主要病理表現(xiàn)為腎小管萎縮和腎小球硬化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。因此，RF是多種因素相互促進(jìn)、相互影響的復(fù)雜病理過程，主要涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、不同細(xì)胞因子分泌及信號級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、MF的增殖和活化，以及上皮細(xì)胞和GEnCs向MF轉(zhuǎn)化等多種因素[17]。

3.3 EndoMT與RF的相關(guān)性

近來發(fā)現(xiàn)，某些病理條件如損傷、炎癥以及衰老可以激活EndoMT并誘導(dǎo)RF[18]。在RF時，10%的MF來源于EndoMT，其余約90%來自原有增殖的纖維母細(xì)胞和骨髓細(xì)胞分化等[19]。Zeisberg等[20]為了明確EndoMT在RF中的作用，于2008年應(yīng)用單側(cè)輸尿管梗阻模型（UUO：梗阻性腎病模型）、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）模型以及系統(tǒng)缺乏膠原Ⅳα3鏈的小鼠模型(Col4A3Ko，Alport綜合征小鼠模型)這三種慢性腎病小鼠模型，對其ECs的遺傳譜系（Tie2-Cre，R26R-Stop-EYFP轉(zhuǎn)基因小鼠ECs譜系）進(jìn)行熒光追蹤，對內(nèi)皮和間質(zhì)表型標(biāo)記物進(jìn)行雙重標(biāo)記，結(jié)果證實MF中確實存在EndoMT來源的GEnCs，這是對EndoMT可能導(dǎo)致RF發(fā)生的首次報告。

上述研究提示，EndoMT已經(jīng)成為現(xiàn)今RF研究的一個重要方向，且此后又陸續(xù)有報道證實EndoMT確實參與了DN早期時的RF[21]。張詩翊等[22]研究顯示，DN時的腎組織中Chemerin、ChemR23含量隨病情進(jìn)展而增加，α-SMA表達(dá)增多，CD31表達(dá)則減少，指出Chemerin/ChemR23參與了DN中的EndoMT過程。Liang等[23]首次報道，高級氧化蛋白產(chǎn)物（AOPPs）可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)觸發(fā)人GEnCs發(fā)生EndoMT，并隨著DN患者血漿AOPPs水平的升高，腎功能也隨之惡化。此外，還有研究證實，激活DKK3/Wnt通路能抑制GEnCs的生長，激活MF，促進(jìn)EndoMT的發(fā)生，而Wnt途徑抑制物sulindac-sulfide可下調(diào)DKK3的表達(dá)，阻止EndoMT的發(fā)生，進(jìn)而抑制RF[24]。因此，靶向EndoMT可能具有治療RF的潛力，但其上下游具體有哪些分子參與作用，還有待進(jìn)一步研究證實。

4 介導(dǎo)EndoMT參與RF的因素

近年來的研究已證實，GEnCs可在多種生物介質(zhì)及信號通路的協(xié)同作用下，暴露于極復(fù)雜的微環(huán)境中發(fā)生EndoMT，并進(jìn)一步導(dǎo)致RF的發(fā)生和發(fā)展。其中的信號通路及生物介質(zhì)包括轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/Smad信號通路、Wnt信號通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、血管緊張素II（AngII）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、各類炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，以及介導(dǎo)多個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄的非編碼微小RNA（microRNA，miRNA）等。

4.1 細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥條件下的EndoMT

一般來說，纖維化作為受損組織的一種修復(fù)機制，其特征是炎癥介質(zhì)的釋放，從而觸發(fā)以結(jié)締組織替代正常細(xì)胞的纖維化過程。這種有益的修復(fù)過程在失控時可導(dǎo)致ECM的異常產(chǎn)生和積累，進(jìn)而永久性瘢痕組織替代了正常細(xì)胞[25]。在炎癥反應(yīng)中，局部免疫細(xì)胞（主要是組織巨噬細(xì)胞）被激活，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致循環(huán)骨髓源性纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和ECs等細(xì)胞被活化。當(dāng)這些細(xì)胞突然從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)向激活狀態(tài)時，會高度表達(dá)α-SMA，并合成ECM成分，甚至轉(zhuǎn)化為MF，即發(fā)生EndoMT[26]。其中比較重要的誘導(dǎo)內(nèi)皮纖維化的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子包括TGF-β、促炎細(xì)胞因子白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等，均已被證明能夠激活GEnCs，并通過基于EndoMT的機制將其轉(zhuǎn)化為MF，即GEnCs在逐漸失去內(nèi)皮標(biāo)志物（如CD-31等）的表達(dá)同時，開始表達(dá)纖維化標(biāo)志物（如α-SMA等），ECM堆積，進(jìn)而促進(jìn)RF的發(fā)生[27]。因此，炎癥條件下誘導(dǎo)的EndoMT過程與RF之間有著密切的關(guān)系。

4.1.1 TGF-β TGF-β是目前研究最為深入且主要的EndoMT誘導(dǎo)因子[28]，其超家族含有38個家族成員，如TGF-β、BMP、抑制素、激活素等，其中TGF-β在慢性腎臟病的進(jìn)展中具有最重要的作用[29]。TGF-β有三種高度保守亞型，稱為TGF-β1/2/3，這三種亞型在組織內(nèi)呈現(xiàn)不同的分布模式和不同的生物學(xué)功能，但都通過不同的作用與EndoMT相關(guān)，且參與RF的發(fā)生[30]。Derada等[31]證實，腦內(nèi)皮細(xì)胞(BECs)在炎癥條件下，TGF-β可誘導(dǎo)BECs發(fā)生EndoMT，導(dǎo)致BECs功能障礙，血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）受損。此過程與GEnCs發(fā)生EndoMT，進(jìn)而造成腎小球濾過屏障受損的機制極為相似。

TGF-β/Smad3是公認(rèn)的導(dǎo)致RF的途徑，Smad3可直接結(jié)合膠原的啟動子區(qū)域，參與ECM的生成和降解。Chen等[32]研究證實了TGF-β可通過Smad3依賴性機制上調(diào)Smad7的合成，進(jìn)而抑制NF-κB的激活和核移位，阻止GEnCs發(fā)生EndoMT。同時還發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，Smad7缺陷型小鼠尿中的微量白蛋白顯著上調(diào)，提示腎小球濾過屏障受損，RF加重。因此，Smad7可負(fù)調(diào)節(jié)炎癥條件下TGF-β/Smad3介導(dǎo)的EndoMT，提示過表達(dá)Smad7可能對RF具有治療潛力。

4.1.2 IL-1β 基于TGF-β可激活NF-κB的機制，Maleszewska等[33]證明了IL-1β和TGF-β2共刺激可導(dǎo)致NF-κB的核移位，協(xié)同誘導(dǎo)EndoMT的發(fā)生。IL-1β是一種促炎癥細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞以非活性形式產(chǎn)生，然后被caspase1激活，再與IL-1β受體（IL1-R1、IL1-RAcP）結(jié)合，誘導(dǎo)白介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）活化，隨后，NF-κB被活化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，介導(dǎo)炎癥條件下的EndoMT。其實早有研究證實IL-1β可對ECs的表型產(chǎn)生影響，這提示IL-1β極有可能介導(dǎo)了EndoMT的發(fā)生。Chaudhuri等[34]則證實了這一設(shè)想，他們證明了IL-1β本身就是EndoMT的誘導(dǎo)因子，且其作用強于TGF-β和TNF-α，而這三種細(xì)胞因子相聯(lián)合，對EndoMT具有更強烈的誘導(dǎo)作用。張盟[35]所在的課題組也通過免疫印跡技術(shù)和ELISA法檢測到UUO模型小鼠腎組織中IL-1β前體和IL-1β的表達(dá)均下降，提示IL-1β可通過直接和間接兩種方式促進(jìn)RF的形成。Mack[36]則通過細(xì)胞系分析確認(rèn)了IL-1β誘導(dǎo)了GEnCs發(fā)生EndoMT。

4.1.3 其他炎癥相關(guān)細(xì)胞因子 由上述可知，NF-κB是炎癥條件下誘導(dǎo)GEnCs發(fā)生EndoMT的關(guān)鍵分子，而其他炎癥相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)EndoMT的發(fā)生過程也與NF-κB的激活和核移位密切相關(guān)。例如，GEnCs中TNF-α通過誘導(dǎo)粘附分子（如血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）和細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1））的表達(dá)來促進(jìn)活化[37]，進(jìn)而與其受體TNF-R結(jié)合，誘導(dǎo)NF-κB向細(xì)胞核移位，誘發(fā)EndoMT。此外，TNF-α還能刺激IL-1β、CCL2和TGF-β1的釋放，在腎小球炎癥和RF中發(fā)揮顯著作用[38]。

4.2 足細(xì)胞損傷介導(dǎo)的EndoMT

足細(xì)胞即腎小球上皮細(xì)胞，其在TGF-β的刺激下分泌的VEGF和Ang-1，具有保護GEnCs的作用[39]。Liang等[40]的體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blocker，ARB）可以影響暴露于嘌呤霉素氨基核苷受損的足細(xì)胞，恢復(fù)足細(xì)胞產(chǎn)生VEGF和Ang-1的功能；進(jìn)而又證實暴露于受損足細(xì)胞上清液的GEnCs無法生長，而暴露于ARB處理的受損足細(xì)胞上清液的GEnCs生長和分枝增強。

由于EndoMT與EMT（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的特征相似，都是失去各自的細(xì)胞表型及細(xì)胞附著力，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈叨惹忠u力、遷徙力、梭形細(xì)長的間充質(zhì)細(xì)胞，因此，EndoMT通常被認(rèn)為是EMT的一種特殊形式[41]。雖然與EMT相比，對EndoMT的了解還相對較少，但兩者都與MF和器官纖維化有關(guān)[42]。且足細(xì)胞的EMT和GEnCs的EndoMT過程中激活產(chǎn)生的MF已證實是腎成纖維細(xì)胞的主要來源，均可引起RF[43]。然而，目前對足細(xì)胞發(fā)生EMT是否也會改變GEnCs的行為尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

4.3 miRNA在EndoMT中的作用

miRNA是一組高度保守的非編碼RNA分子序列，由近22個核苷酸組成，可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制和降解靶mRNA，導(dǎo)致基因和蛋白的表達(dá)受到抑制。高血糖、炎性細(xì)胞因子、衰老、高血壓和缺氧的累積均可導(dǎo)致腎臟中miRNA表達(dá)譜的改變，并誘導(dǎo)EndoMT的發(fā)生，最終導(dǎo)致RF[44]。miRNA可在上述病理過程介導(dǎo)相關(guān)分子表達(dá)的改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)和功能，甚至發(fā)生細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)化。其中大多數(shù)miRNA是通過與TGF-β作用來介導(dǎo)EndoMT，進(jìn)而促進(jìn)RF的發(fā)生[11]。

4.3.1 miR-21 Kumarswamy等[45]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以通過沉默磷酸酶和張力素同源物（PTEN）基因或是激活A(yù)kt信號通路上調(diào)miR-21的表達(dá)，誘導(dǎo)EndoMT的發(fā)生，促進(jìn)纖維化。miR-21還可通過靶向過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）來放大TGF-β1/Smad3信號通路，從而明顯促進(jìn)AngII誘導(dǎo)的RF[46]。與Smad3信號會使miR-21在腎臟中的表達(dá)大幅度上升不同，TGF-β/Smad信號通路的另一個下游效應(yīng)子Smad2信號會反向調(diào)節(jié)Smad3，下調(diào)miR-21的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對腎臟的保護作用[47]。此外，在高濃度葡萄糖干預(yù)下，GEnCs中miR-21的表達(dá)上調(diào)，PTEN/AKT/eNOS通路被激活，抑制MAPK/ET-1通路，從而影響GEnCs的分泌功能[48]。此外，有研究證實，miR-21的上調(diào)有效地激活了阻塞性腎臟病中的EndoMT的發(fā)生，加速了RF的進(jìn)程[49]。

4.3.2 miR-29s Kanasaki等[50]通過分析DM小鼠腎臟的miRNA圖譜發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠腎臟相比，DM小鼠腎臟中miR-29家族（miR-29s，包括miR29a/b/c）的表達(dá)被抑制。在進(jìn)一步的實驗中，他們證明了二肽基肽酶-4（DPP-4）為miR-29s的下游靶點，且發(fā)現(xiàn)被利格列?。―PP-4抑制劑）作用下的人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMVEC）中miR-29s的表達(dá)上調(diào)，EndoMT也有所改善。此外，Srivastava[51]課題組還證實了miR-29s可聯(lián)合miR-let-7s，共同上調(diào)TGF-β2誘導(dǎo)的DPP-4水平，在DN時的RF中起著抗EndoMT的作用。

4.4.3 其他 miRNAmiR-155可以通過促進(jìn)TGF-β1分泌來刺激EndoMT的發(fā)生[52]。Ghosh等[53]通過miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-125b可靶向P53增強TGF-β誘導(dǎo)的纖維化信號，促進(jìn)EndoMT的發(fā)生。此外，miR-200a的過表達(dá)可阻斷GEnCs的EndoMT，且miR-200a是通過TGF-β1/miR-200a/GRB2/EndoMT通路來調(diào)節(jié)RF的進(jìn)程； miR-200a還可誘導(dǎo)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT的發(fā)生。因此，miR-200a可能成為未來各類因EndoMT導(dǎo)致的組織纖維化提供治療新靶點[54]。

5 小結(jié)與展望

目前，盡管在動物和細(xì)胞實驗中有大量的EndoMT促進(jìn)RF發(fā)生的證據(jù)，但是在人類臨床中的研究較少，而且對于EndoMT發(fā)生的細(xì)胞和分子機制有待于進(jìn)一步研究。EndoMT可能成為是慢性腎臟病抗纖維化治療靶點，根據(jù)EndoMT發(fā)生的機制，可采用炎癥因子阻斷劑如IL-1β和TNF-α的抑制劑、TGF-β信號通路阻斷劑、足細(xì)胞EMT抑制劑等延緩RF的進(jìn)展。同時，隨著基因水平研究的不斷深入，未來的研究工作還應(yīng)該著重研究miRNA介導(dǎo)EndoMT的作用機制，這會給人類RF疾病的治療提供一種全新的靶點和方法。