微小核糖核酸與骨不連

黃麗麗，章海軍，何 悅，黃嘉琛，劉 源，胡 軍

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科,南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,南京 210029)

骨不連是長骨骨折后較為常見的一種并發(fā)癥，通常被定義為骨折超過9個月仍未愈合，并已連續(xù)3個月沒有任何愈合跡象[1],盡管大多數(shù)骨折都能夠?qū)崿F(xiàn)正常愈合，但仍5%～10%會發(fā)生骨不連[2]。由于骨不連發(fā)生率較高，且治療難度大，一直是國內(nèi)外臨床醫(yī)師面臨的難點(diǎn)和挑戰(zhàn)。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)生性非編碼小分子RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA可以調(diào)節(jié)特定靶基因的表達(dá)而對骨不連發(fā)生發(fā)展過程中炎癥反應(yīng)、血管生成、成骨細(xì)胞分化及遷移等過程產(chǎn)生影響。但目前為止，未有對miRNA和骨不連之間的具體作用機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)分析總結(jié)，因此，本文就兩者之間的相關(guān)性作一綜述，這為研究骨不連的發(fā)生發(fā)展提供了理論依據(jù)，為骨不連的診斷和治療提供新的方向。

1 miRNA的生物學(xué)特征

miRNA是一類內(nèi)生性非編碼小分子RNA，長18～22個核苷酸，并且在整個進(jìn)化過程中高度保守，可以調(diào)控基因的表達(dá)[4]，是眾多生物過程的調(diào)控因子，包括發(fā)育、增殖、凋亡和細(xì)胞代謝等[5]。異常的miRNA表達(dá)會改變細(xì)胞內(nèi)的翻譯環(huán)境，導(dǎo)致有害的表型結(jié)果或疾病狀態(tài)[6]。目前研究已經(jīng)表明miRNA的異常表達(dá)與多種骨科疾病之間關(guān)系密切。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中表達(dá)上調(diào)，且在骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射miR-21-5p拮抗劑后可以顯著減輕關(guān)節(jié)軟骨退化，從而改善骨關(guān)節(jié)炎。在骨骼生物學(xué)領(lǐng)域，miRNA有助于調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和功能，在骨折中發(fā)揮重要作用[8]。最近一項(xiàng)研究表明成骨細(xì)胞中的miR-29a可以通過抑制破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子核因子κB受體活化因子配體和CXC型趨化因子配體12來減少破骨細(xì)胞分化，從而減少骨質(zhì)疏松對人體的傷害[9]。骨不連的發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨著多種信號通路的激活，如核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路、Wnt/β-catenin信號通路，這些信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、淋巴增強(qiáng)因子1等可以通過促進(jìn)相關(guān)miRNA的轉(zhuǎn)錄從而使相關(guān)miRNA表達(dá)增加，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨不連中的炎癥反應(yīng)和骨骼生長等過程[10-11]。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以調(diào)節(jié)特定靶基因的表達(dá)而對骨不連發(fā)生發(fā)展過程中炎癥反應(yīng)、血管生成、成骨細(xì)胞分化及遷移等過程產(chǎn)生影響，下面就其在骨不連中具體作用機(jī)制作詳細(xì)描述。

2 miRNA在骨不連中的作用

2.1miRNA在骨不連炎癥反應(yīng)中的作用 在骨折愈合早期，骨折部位出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子釋放，釋放的炎癥因子可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的募集、刺激成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞等。miRNA可以通過作用于骨折愈合過程中的炎癥反應(yīng)來影響骨不連的發(fā)生發(fā)展。一項(xiàng)研究在患有糖尿病的大鼠閉合性橫向骨折模型中發(fā)現(xiàn)miR-181a-1-3p可以直接通過靶向降低IL-1α的表達(dá)，導(dǎo)致骨折愈合過程中正常炎癥反應(yīng)的失調(diào)，從而導(dǎo)致骨折愈合受損，甚至愈合延遲和骨不連[12]。Gerstenfeld等[13]發(fā)現(xiàn)在TNF-α受體基因敲除的脛骨骨干閉合性骨折小鼠中骨折愈合會嚴(yán)重受損，并產(chǎn)生膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化延遲。而Waki等[14]通過一系列通過灼燒骨折部位骨膜構(gòu)建的大鼠骨不連模型的研究中發(fā)現(xiàn)miR-140-3p的表達(dá)比正常骨折愈合組的有明顯改變，miR-140-3p可以通過靶向作用于NF-κB的共激活劑核受體輔激活蛋白1和核受體相互作用蛋白1，從而負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)。而激活的NF-κB可作為TNF-α信號通路的重要反應(yīng)分子，說明miR-140-3p對骨不連的炎癥反應(yīng)中的炎癥因子起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[15]。另一項(xiàng)通過股骨截骨所致的骨不連小鼠中也發(fā)現(xiàn)miR-140-3p的升高，且也是作用于NF-κB來抑制炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致骨折愈合受損[16]。此外，Waki等[14]研究還發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p和miR-451a在骨不連組表達(dá)增高，而這三種miRNA均已被證實(shí)參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[17-19]，miR-181a-5p可以通過直接靶向降低IL-1α水平調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，miR-451a則通過作用于14-3-3ζ和RAS癌基因家族成員Rab5a來抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的表達(dá)。在炎癥信號通路中，炎癥因子TNF-α和IL-1α可以激活MAPK的表達(dá)，MAPK通路的激活也會促進(jìn)這些炎癥因子的生成，這些結(jié)果都提示miR-451a和miR-181a-5p在骨不連的炎癥因子的產(chǎn)生起調(diào)節(jié)作用[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)骨不連大鼠的miR-31a-5p,miR-146a-5p,miR-146b-5p和miR-223-3p的表達(dá)與正常愈合大鼠之間存在差異[20]。這些miRNA都參與調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，抑制miR-31a-5p的表達(dá)可通過Wnt/β-catenin信號通路來降低熱應(yīng)激下人真皮成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)并提高其細(xì)胞存活率[21]，miR-146a-5p可以抑制促炎因子IL-1β、IL-6的表達(dá)[22]，而阻斷miR-146b-5p會增加動脈粥樣硬化相關(guān)泡沫細(xì)胞形成中的炎癥反應(yīng)[23]，miR-223-3p可以靶向作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3來負(fù)性調(diào)節(jié)IL-1和IL-6的表達(dá)[24]。

2.2miRNA在骨不連骨骼生長中的作用 成骨、軟骨形成和血管生成是骨折愈合修復(fù)階段的主要過程。成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖及分化功能受損，或血管形成異常均會導(dǎo)致骨折愈合障礙甚至不愈合[25]。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是轉(zhuǎn)化因子超家族的成員，可以通過刺激細(xì)胞增殖、分化和趨化、細(xì)胞黏附以及血管形成來刺激新生骨形成，增加新生骨痂的力學(xué)強(qiáng)度，從而促進(jìn)骨折愈合[26]。相關(guān)研究表明miR-140-5p可以抑制未分化的人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用，且可調(diào)節(jié)人脂肪干細(xì)胞的成脂和成骨平衡[27]，而BMP-2已被證實(shí)是miR-140-5p作用靶點(diǎn)[28]。Takahara等[12]在大鼠股骨閉合性橫斷骨折模型研究中發(fā)現(xiàn)miR-140-5p可以通過作用于靶基因天冬酰氨肽酶來抑制BMP信號通路，從而使骨折愈合中的成骨，軟骨形成和軟骨內(nèi)骨化過程受損，導(dǎo)致骨不連。Waki等[14]在灼燒骨折部位骨膜形成骨不連的大鼠中也發(fā)現(xiàn)miR-140-5p表達(dá)明顯下降。miRNA除了作用于BMP-2，最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-342-5p可以通過上調(diào)BMP-7的表達(dá)，激活絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號傳導(dǎo)通路，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和遷移[29]，在骨不連發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

Wnt/β-catenin信號通路在成骨分化中促進(jìn)細(xì)胞增殖和礦化、阻止細(xì)胞凋亡，還可促進(jìn)間充質(zhì)祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，在骨折愈合中發(fā)揮著重要作用[30]。Pannexin間隙連接蛋白3(pannexin gap junction protein family member 3，PANX3)是由軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化誘導(dǎo)而來[31]，Jia和Zhou[32]開展一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-367的表達(dá)則會通過激活PANX3介導(dǎo)的Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞在骨折過程中的生長和增殖，說明miRNA可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來影響骨折愈合甚至骨不連。此外，有研究表明miR-381在萎縮性骨不連形成過程中通過與Wnt5a和卷曲同源物3的3’端非編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)β-catenin的核轉(zhuǎn)位，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路，調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用[33]。同樣，miRNA也可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路來調(diào)節(jié)骨不連的骨骼生長。Sun等[34]研究表明將miR-26a模擬物注射入骨不連大鼠中后引起miR-26a過表達(dá)，可以觀察到骨鈣素和堿性磷酸酶表達(dá)增加，表明促進(jìn)了骨折的愈合，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)硬化蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白1(sclerostin domain-containing1，SOSTDC1)可以負(fù)性調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，且SOSTDC1已被證實(shí)可以抑制骨折愈合。他們進(jìn)一步推測miR-26a可能通過靶向抑制SOSTDC1的表達(dá)從而進(jìn)一步激活Wnt/β-catenin信號通路，增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對促進(jìn)骨不連大鼠骨折愈合的作用。

2.3miRNA在骨不連血管生成中的作用 充分且穩(wěn)定的血液供應(yīng)對于骨折愈合至關(guān)重要，如果骨折愈合過程中血管生成不佳，導(dǎo)致骨折愈合延遲甚至骨不連。miR-210-3p在低氧后的反應(yīng)性血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其過表達(dá)后可以增強(qiáng)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)驅(qū)動的內(nèi)皮細(xì)胞遷移。miR-210-3p在低氧狀態(tài)下的相關(guān)靶向作用點(diǎn)是促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體配體A3(erythropoietin-producing hepatocellular receptor ligand-A3，Ephrin-A3)，Ephrin-A3可以通過VEGF途徑控制的Eph-Ephrin系統(tǒng)，調(diào)節(jié)血管生成[35]，有研究證明通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射雙鏈miR-210-3p可以增加血管生成從而促進(jìn)大鼠前交叉韌帶部分撕裂的愈合[36]。Takahara等[12]對大鼠閉合性股骨干橫行骨折研究后表明miR-210-3p在骨折愈合后期表達(dá)下降可能會抑制骨折愈合過程中正常血管生成，從而導(dǎo)致骨折愈合不良甚至骨不連。同時，他們還發(fā)現(xiàn)miR-222-3p在骨折愈合早期表達(dá)增高時可以抑制血管生成，影響骨折愈合。miR-222-3p可以通過直接抑制干細(xì)胞生長因子受體的表達(dá)來減少細(xì)胞存活、遷移，從而抑制血管形成，使骨折愈合延遲甚至發(fā)生骨不連。

3 miRNA作為骨不連診斷和治療的新靶點(diǎn)

目前骨不連的診斷主要依靠影像學(xué)檢查，其中X線片和CT是臨床上運(yùn)用最廣泛的診斷方法，但亦存在一定的局限性，如營養(yǎng)不良性骨不連較難在早期通過影像學(xué)檢查明確診斷。同時，感染性骨不連由于微生物培養(yǎng)陽性率低，且非特性炎性指標(biāo)診斷效能低，急需一種更具優(yōu)勢的診斷指標(biāo)來診斷[37]。臨床上檢測miRNA的方法主要有實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)、熒光原位雜交技術(shù)、miRNA芯片技術(shù)等。Romeo等[38]使用qRT-PCR檢測血漿中miR-375的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-375升高是晚期甲狀腺髓樣癌患者預(yù)后不良的可靠檢測指標(biāo)。而Renwick等[39]研究使用熒光原位雜交技術(shù)對腫瘤活檢組織中miRNA進(jìn)行檢測，用于鑒別皮膚基底細(xì)胞癌和梅克爾細(xì)胞癌。此外，Duan等[40]利用miRNA芯片技術(shù)篩選出在阿霉素耐藥的骨肉瘤中表達(dá)明顯改變的miRNA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-15b的表達(dá)可以改善骨肉瘤化療耐藥。關(guān)于miRNA成本，Charytonowicz等[41]的研究通過對睪丸惡性生殖細(xì)胞腫瘤術(shù)后或化療后疾病監(jiān)測的成本分析發(fā)現(xiàn)，miRNA檢測對比于CT檢查作為復(fù)查指標(biāo)可使10年內(nèi)的復(fù)查成本減少約8 560美元，相對節(jié)省約44%預(yù)期成本。說明miRNA檢測具有臨床經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，提示使用miRNA作為疾病監(jiān)測的生物標(biāo)志物前景廣闊。miRNA作為調(diào)節(jié)體內(nèi)基因表達(dá)的重要分子，與骨不連中的炎癥反應(yīng)、骨形成與軟骨形成、血管生成等均證實(shí)存在聯(lián)系。Scimeca和Verron[42]關(guān)于miRNA如何運(yùn)用于骨折愈合領(lǐng)域提出了3條建議：(1)確定靶標(biāo)miRNA并決定是否增加或降低其表達(dá)；(2)設(shè)計如何替代miRNA或抑制其表達(dá)；(3)使用特定運(yùn)輸方法來遞送miRNA，并考慮其類型、轉(zhuǎn)染效率和特異性。這些都為今后如何將miRNA應(yīng)用于骨不連診斷和治療提供新的思路。

目前臨床上對于骨不連的治療仍以手術(shù)治療為主，如髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)、自體骨移植術(shù)等，此外一些促進(jìn)骨折愈合的生長因子如骨形成蛋白、硬化分子等也被用于骨不連的治療，基于miRNA的骨不連治療目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，Zhang等[43]研究使用一種幾乎無細(xì)胞毒性的超支化聚合物用于結(jié)合miRNA，并用可生物降解的微球?qū)烧哌M(jìn)行包裹，微球連接到無細(xì)胞的納米纖維聚合物支架上，該支架可在空間上控制miR-26a的釋放。這項(xiàng)技術(shù)通過控制miR-26a靶向作用于糖原合成酶激酶-3β進(jìn)而激活內(nèi)源性干細(xì)胞的成骨細(xì)胞活性，用于治療小鼠顱骨臨界性骨缺損，但miRNA用于臨床治療骨不連的相關(guān)報道仍然較少，需要進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)和展望

作為骨折常見的一種并發(fā)癥，骨不連會造成患者長期行動不便和慢性疼痛，甚至導(dǎo)致再次手術(shù)、生活質(zhì)量嚴(yán)重下降、無法正常工作。本篇綜述初步介紹miRNA與骨不連之間的聯(lián)系，闡述這些miRNA在骨不連中分子作用機(jī)制，可為骨不連臨床診斷的生化標(biāo)志物、基因治療的靶向藥物設(shè)計等方面研究提供新的思路。目前骨不連的診斷和治療仍存在一定的難點(diǎn)和挑戰(zhàn)，然而隨著基于miRNA的骨骼生物學(xué)研究的不斷深入，有望在加速骨折愈合，提高難治性骨不連救治成功率及改善骨折患者預(yù)后等方面逐漸取得一定的突破。