線粒體移植的研究進(jìn)展

王一川，劉小靜，葉 峰，楊雪亮，陳 娜，吳劍華，李彥霖

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染科，陜西 西安 710016)

線粒體提供細(xì)胞生命活動(dòng)的大部分能量，其功能障礙與人類疾病有關(guān)，包括神經(jīng)和肌肉退化、心血管疾病、肥胖、糖尿病、衰老和罕見(jiàn)的線粒體疾病。線粒體移植治療是從正常組織細(xì)胞分離線粒體，然后注入患者線粒體損傷或缺失的部位，使損傷細(xì)胞獲得救治、器官功能得以恢復(fù)的全新干預(yù)技術(shù)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，線粒體移植作為治療包括心臟、肝臟、肺和大腦在內(nèi)的各種組織的線粒體損傷的有效性已經(jīng)有報(bào)道。在臨床試驗(yàn)中，這種方法僅在一項(xiàng)改善先天性心臟病的心肌缺血再灌注損傷的研究被報(bào)道[1]，尚未廣泛應(yīng)用。因此，本文總結(jié)了線粒體移植的研究現(xiàn)狀，希望能對(duì)研究者有所啟發(fā)。

1 線粒體的結(jié)構(gòu)、功能和病理狀態(tài)

線粒體由雙層膜結(jié)構(gòu)套疊而成，將線粒體內(nèi)部空間分成兩個(gè)膜性空間。線粒體外層單位膜光滑平整，由1/2的脂類和1/2的蛋白質(zhì)組成。線粒體內(nèi)膜比外膜稍薄，將內(nèi)膜基質(zhì)分成膜間腔和基質(zhì)腔兩個(gè)部分，內(nèi)膜上大量向基質(zhì)腔凸起的結(jié)構(gòu)形成嵴，這樣的結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了線粒體內(nèi)膜面積，提高了線粒體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的效率。線粒體DNA是裸露在基質(zhì)或附著于內(nèi)膜的雙鏈環(huán)狀分子，編碼線粒體的少部分RNA和蛋白質(zhì)。功能上，外膜上有大量物質(zhì)進(jìn)出線粒體的通道蛋白和特異性受體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)膜的電子傳遞鏈與內(nèi)膜表面附著的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合酶復(fù)合體共同完成氧化磷酸化和ATP的合成。線粒體基質(zhì)則是各種有機(jī)物進(jìn)行最后氧化過(guò)程的場(chǎng)所。只有經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)，有機(jī)物才能完全氧化，產(chǎn)生比無(wú)氧酵解所提供的更多能量。

線粒體的形態(tài)、大小、數(shù)量和排列分布根據(jù)細(xì)胞的類型和生理狀態(tài)而不同。線粒體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，啟動(dòng)mtDNA轉(zhuǎn)錄程序緩解應(yīng)激、將部分線粒體轉(zhuǎn)移到線粒體衍生囊泡、激活線粒體自噬[2]以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡等機(jī)制；在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為線粒體腫脹破裂，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)液化消失等。這些病理狀態(tài)下線粒體功能異常，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生代謝障礙，引起肌肉、神經(jīng)、心肌疾病和凋亡等?，F(xiàn)有的治療措施主要基于分子水平，包括補(bǔ)充輔酶，減少對(duì)缺陷線粒體的排斥和替代缺陷mtDNA等。

2 線粒體轉(zhuǎn)移的機(jī)制

2.1 線粒體細(xì)胞間轉(zhuǎn)移機(jī)制

線粒體起源的內(nèi)共生學(xué)說(shuō)認(rèn)為，古線粒體作為一種需氧菌被原始真核細(xì)胞吞噬，在長(zhǎng)期互利共生中演化成了現(xiàn)在的線粒體細(xì)胞器。這個(gè)假說(shuō)提示了細(xì)胞具有觸發(fā)細(xì)胞器交換的機(jī)制，以響應(yīng)來(lái)自受累細(xì)胞的損傷信號(hào)。然而，啟動(dòng)這一過(guò)程的分子線索仍然不明。以神經(jīng)元為例，當(dāng)大鼠皮層神經(jīng)元受到缺氧葡萄糖剝奪時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，神經(jīng)元活力下降；當(dāng)添加星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞外線粒體顆粒后，神經(jīng)元活力恢復(fù)[3]。目前的動(dòng)物器官缺血再灌注模型大多通過(guò)血管輸送或直接注射的方法快速有效地完成移植。經(jīng)腹腔靜脈注射后，外源性線粒體分布于小鼠腦、肝、腎、肌肉、心臟等多種組織。然而細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移途徑，外源性線粒體通過(guò)生理屏障(如血腦屏障)的機(jī)制依然有待研究。

細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要由隧道納米管(tunnel-ing nanotube,TNT)、間隙連接和細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的釋放等發(fā)揮作用。TNT是由與靶細(xì)胞相連的絲狀細(xì)胞膜突起產(chǎn)生的納米管狀的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。每個(gè)細(xì)胞的膜延伸融合在一起，從而形成一個(gè)緊密連接的橋，它不是固定在膜上，而是懸浮在細(xì)胞外空間。TNT參與肺上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞等的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)、修復(fù)細(xì)胞損傷、激活增強(qiáng)免疫反應(yīng)和細(xì)胞代謝重編程。ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)磷脂肌醇3-激酶也與連接蛋白通道的打開(kāi)有關(guān)[4]。供體細(xì)胞釋放的EVs可以與接收細(xì)胞融合或吞噬來(lái)釋放其中的線粒體，動(dòng)脈內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的EVs可減輕局灶性腦損傷引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)[5]。在糖尿病心肌缺血的大鼠模型中證實(shí)了肌動(dòng)蛋白在線粒體細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的重要性[6]。

2.2 移植線粒體的來(lái)源和移植后免疫反應(yīng)

干細(xì)胞有強(qiáng)大的再生潛力，因此被認(rèn)為是可靠的線粒體來(lái)源。不同供體細(xì)胞的線粒體也有不同的功能?；诩?xì)胞對(duì)低氧的不同反應(yīng)，將大鼠從股動(dòng)脈分離出的線粒體與低氧的肺動(dòng)脈段共孵育培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，低氧時(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的ROS要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線粒體。股動(dòng)脈平滑肌線粒體移植能抑制低氧引起的肺循環(huán)阻力升高[7]。

免疫排斥方面，通過(guò)觀察小鼠自體和同種異體的線粒體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，不管是單次注射還是連續(xù)注射，不管是自體細(xì)胞還是異體細(xì)胞線粒體注射，與空白對(duì)照組相比，血清炎性標(biāo)志物都無(wú)明顯差異[8]。結(jié)合古線粒體內(nèi)共生來(lái)源學(xué)說(shuō)，外源性線粒體移植不易引起明顯免疫排斥反應(yīng)的現(xiàn)象有助于擴(kuò)大線粒體供體源，為推廣異體線粒體移植治療提供可能。

線粒體移植機(jī)制的研究為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也對(duì)線粒體移植的應(yīng)用提供了更多思路。

3 線粒體移植的臨床探索

3.1 線粒體移植改善缺血/再灌注損傷

3.1.1 心臟缺血/再灌注損傷:缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/RI)是導(dǎo)致線粒體損傷最常見(jiàn)的原因，也是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的模型機(jī)制。在心肌缺血再灌注動(dòng)物模型中初步驗(yàn)證了心肌源性線粒體的治療作用[9]。結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈左前降支，缺血后將供體兔左心室的線粒體直接注射到心臟缺血的部位，發(fā)現(xiàn)心肌梗死標(biāo)志物水平顯著降低。隨后驗(yàn)證了自體線粒體移植的策略，即從骨骼肌中提取的健康的自體線粒體移植到損傷的心肌中，觀察到的線粒體移植組梗死范圍比空白對(duì)照組顯著減少[10]。超聲心動(dòng)圖顯示整體功能無(wú)明顯差異。組織化學(xué)和透射電鏡顯示，在對(duì)照組心肌組織受損，而在線粒體組則不明顯。用同樣方法提取的線粒體注入糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈也被證實(shí)能夠改善心肌缺血的損傷[1]。

線粒體移植在再灌注過(guò)程中，而不是在再灌注前立即給予冠狀動(dòng)脈的問(wèn)題更接近實(shí)際[11]。超聲心動(dòng)圖分析顯示，再灌注時(shí)，局部I/RI后接受線粒體移植的心臟射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率和梗死面積/危險(xiǎn)區(qū)域(infarct size/area at risk IS/AAR)都有明顯改善。再灌注結(jié)束時(shí)，兩組在左室舒張末期壓和左室壓升高速率等整體左室功能測(cè)量值上存在差異。兩組之間在危險(xiǎn)區(qū)域沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異。與對(duì)照組相比，接受線粒體移植的IS/AAR明顯減小。

循環(huán)死亡后捐獻(xiàn)(donation after circulatory death,DCD)提供了另一種異體心臟移植來(lái)源，但由于缺血的影響而受到限制。研究表明線粒體移植增強(qiáng)DCD心臟心肌功能的效果[12]。停止機(jī)械通氣使約克豬循環(huán)衰竭，熱缺血20 min后，給予心臟停搏液。然后在離體血液灌注系統(tǒng)進(jìn)行心臟再灌注，15 min后，心臟接受溶劑或含有自體線粒體的注射液，實(shí)驗(yàn)組在離體心臟灌注2 h后接受第二次線粒體注射。與溶劑組相比，接受線粒體注射液組的左心室/心室峰值發(fā)展壓力、最大左心室/心室壓力升高，左室縮短分?jǐn)?shù)和心肌耗氧量顯著增加，心肌梗死面積明顯縮小。這一研究表明線粒體移植顯著地保留了DCD心臟的心肌功能和耗氧量，從而為擴(kuò)大心臟供體池提供了可能的選擇。

對(duì)先天性心臟病手術(shù)干預(yù)和體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)支持沒(méi)有改善的患兒從自體腹直肌中分離出線粒體，然后從心外膜注入超聲心動(dòng)圖提示有缺血再灌注損傷的心肌中[1]。所有患者均無(wú)與心外膜注射相關(guān)的心律失?；虺鲅?例患者中，4例心室功能改善，并成功脫離ECMO支持。注射前和注射后全身炎性反應(yīng)綜合征的標(biāo)志物(穩(wěn)定的呼吸和腎臟狀態(tài))無(wú)明顯差異，這與動(dòng)物研究數(shù)據(jù)一致。其中一例患者的尸檢顯示在注射部位沒(méi)有炎性或排斥的跡象，白細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有臨床相關(guān)變化，提示自體線粒體移植不會(huì)引起明顯的炎性反應(yīng)。然而，選擇這組患者是因?yàn)镋CMO支持后心肌功能未恢復(fù)，而且心室功能的恢復(fù)也希望渺茫。評(píng)估不同治療時(shí)機(jī)，確定線粒體的劑量和不同給藥方法仍有待研究。

3.1.2 肺缺血/再灌注損傷：缺血/再灌注損傷是導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)最常見(jiàn)的原因之一。體外氣體交換、體外循環(huán)和機(jī)械通氣均可導(dǎo)致I/RI。I/RI對(duì)肺功能和細(xì)胞活力有深遠(yuǎn)影響，并顯著增加兒童和成人患者的發(fā)病率和病死率。線粒體損傷在ALI中起著重要作用，為肺I/RI的治療提供策略。

用雄性C57BL/6J小鼠研究了線粒體移植在小鼠肺I/RI模型中的效果。通過(guò)開(kāi)胸手術(shù)在左肺門(mén)部應(yīng)用微血管鉗夾閉2 h誘發(fā)短暫性缺血[13]。再灌注后，小鼠通過(guò)肺動(dòng)脈血管或吸入氣管氣霧劑給藥，給小鼠注射含有線粒體的載體或空白載體。假對(duì)照組小鼠開(kāi)胸不夾閉肺門(mén)。24 h后，評(píng)估肺力學(xué)參數(shù)并收集肺部組織進(jìn)行分析。結(jié)果表明，再灌注24 h后，與相應(yīng)的溶媒組相比，線粒體吸入組的動(dòng)態(tài)順應(yīng)性和吸氣量顯著增加，阻力、組織阻尼、彈性和吸氣峰壓(僅動(dòng)脈注射組)顯著降低；與假對(duì)照組相比，線粒體移植組中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫和凋亡明顯減少。各組間細(xì)胞因子和趨化因子無(wú)明顯差異。這些結(jié)果表明，血管輸送或霧化吸入線粒體移植都可以改善肺機(jī)械功能，減少肺組織損傷。

3.1.3 骨骼肌缺血/再灌注損傷:骨骼肌也是富含線粒體的重要器官。在小鼠的左后肢急性缺血模型中，用止血帶引起缺血2 h后，恢復(fù)后肢再灌注。將空白對(duì)照或線粒體溶液直接注射到后肢的所有肌肉中。線粒體以不同濃度梯度被注射到每塊肌肉。假性對(duì)照組不接受缺血或注射，但麻醉2 h后恢復(fù)。在后肢再灌注24 h后，線粒體移植組小鼠腓腸肌、比目魚(yú)肌和股內(nèi)側(cè)肌的梗死面積比空白對(duì)照組明顯減少，后肢的站立能力明顯增強(qiáng)，站立能力與非缺血組無(wú)明顯差異[14]。

3.1.4 腎臟缺血/再灌注損傷:腎臟的線粒體含量和耗氧率僅次于心臟。由于線粒體的功能和生存能力依賴于血液輸送的穩(wěn)定氧氣供應(yīng)，氧氣輸送的中斷或停止以及由此產(chǎn)生的I/RI嚴(yán)重?fù)p害線粒體的能量生產(chǎn)，導(dǎo)致腎功能不全或衰竭。以豬雙側(cè)腎缺血再灌注損傷為模型研究線粒體移植的腎臟作用[15]。用球囊導(dǎo)管對(duì)雌性約克郡豬進(jìn)行經(jīng)皮雙側(cè)腎動(dòng)脈暫時(shí)閉塞術(shù)，缺血60 min后，將球囊導(dǎo)管放氣，以單次給藥的方式將線粒體輸送至腎動(dòng)脈。注入的線粒體迅速被腎臟吸收，分布在皮質(zhì)和髓質(zhì)的管狀上皮細(xì)胞中。再灌注24 h后，與溶劑組相比，線粒體治療組血尿素氮明顯降低。大體解剖、病理組織學(xué)分析、急性腎小管壞死評(píng)分和透射電鏡顯示，溶劑組的腎皮質(zhì)主要是近端小管發(fā)生廣泛的凝固性壞死，而線粒體移植腎僅表現(xiàn)為斑片狀輕度急性腎小管損傷。與接受線粒體移植的腎臟相比，溶劑處理的腎臟的腎皮質(zhì)IL-6表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明，動(dòng)脈內(nèi)注射線粒體可保護(hù)腎臟免受缺血再灌注損傷，顯著增強(qiáng)腎功能，減輕腎損害。

3.2 線粒體移植改善代謝功能

線粒體功能障礙導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，是引起非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的一個(gè)重要機(jī)制。外源性線粒體對(duì)高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝有治療作用[16]。他們用小鼠隨機(jī)分為4組(每組12只)。第一組為正常對(duì)照組，其余3組灌胃給予高脂高膽固醇飼料，線粒體治療1組小鼠3 d內(nèi)靜脈注射從肝癌細(xì)胞中分離的線粒體，共3次；治療2組小鼠接受線粒體6次。脂肪肝組給予等量0.9%氯化鈉溶液。用GFP標(biāo)記線粒體，觀察靜脈注射后外源性線粒體在體內(nèi)的分布。小鼠注射2 h后，肝、肺、腦、肌、腎出現(xiàn)熒光，表明熒光蛋白標(biāo)記的線粒體可進(jìn)入小鼠組織細(xì)胞。線粒體治療組血清轉(zhuǎn)氨酶活性和膽固醇水平呈劑量依賴性下降。同時(shí)減少了脂肪肝小鼠的脂質(zhì)積累和氧化損傷，提高能量的產(chǎn)生，從而恢復(fù)肝細(xì)胞功能。線粒體移植治療策略為NAFLD的治療提供了一種新的潛在的治療途徑。

3.3 線粒體移植改善神經(jīng)功能

神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)不同的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)機(jī)制維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為這種交流的一個(gè)重要例子。大量證據(jù)表明線粒體功能的損傷對(duì)于帕金森的疾病進(jìn)展有重要作用[17]。然而由于線粒體蛋白和DNA結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，線粒體靶向藥物只能提供有限的神經(jīng)保護(hù)。在小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，補(bǔ)充線粒體組的小鼠耐力增強(qiáng);而在帕金森病模型小鼠中，線粒體移植通過(guò)增加電子傳遞鏈的活性、降低活性氧水平、防止細(xì)胞凋亡和壞死來(lái)阻止帕金森病的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展[17]。

在一種短暫局部腦缺血模型中，用星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外線粒體，注射到局灶性腦缺血小鼠模型的梗死周圍區(qū)域后，可被神經(jīng)元獲取，這表明線粒體注射可能是治療卒中的一種新的治療方法[3]。從進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在接受高壓氧預(yù)處理從星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)移線粒體可以減輕大鼠神經(jīng)元的缺血死亡[18]。腦脊液mtDNA減少是神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)特征，如帕金森病、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和多發(fā)性硬化癥[19]。一項(xiàng)阿爾茨海默病生物標(biāo)志候選物的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選中發(fā)現(xiàn)的潛在AD信號(hào)中59%是線粒體蛋白，強(qiáng)調(diào)了線粒體功能障礙在AD中的重要地位[20]。然而，線粒體功能障礙是否存在于所有神經(jīng)退行性疾病中，以及它與神經(jīng)退行性病變的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

小膠質(zhì)細(xì)胞活化和線粒體功能障礙是膿毒癥引起腦功能障礙的兩個(gè)主要因素。線粒體功能障礙可改變小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫特性，使其趨向促炎性表型。線粒體治療通過(guò)增強(qiáng)從M1表型到M2表型的小膠質(zhì)細(xì)胞極化和抑制小膠質(zhì)來(lái)源的炎性細(xì)胞因子的釋放來(lái)提供神經(jīng)保護(hù)，改善了膿毒癥幸存者的認(rèn)知障礙，支持了外源性線粒體移植療法的潛在應(yīng)用。

3.4 線粒體移植對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響

癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)能重塑癌細(xì)胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)和基因組表達(dá)，從而使癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。在前列腺癌[21]和急性淋巴細(xì)胞白血病[22]中，初級(jí)CAFs已經(jīng)被證明通過(guò)TNT將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞。從CAFs水平轉(zhuǎn)移功能性線粒體可提高前列腺癌細(xì)胞線粒體的質(zhì)量和活性，從而進(jìn)一步促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生[21]。在骨髓微環(huán)境中，抗腫瘤藥物可以刺激胞吞作用的線粒體轉(zhuǎn)移，黏附于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞的ATP含量增加，從而產(chǎn)生阿糖胞苷藥物的抗性[23]。線粒體轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)分子可能成為新的化療藥物作用靶點(diǎn)。

從星形膠質(zhì)細(xì)胞中提取的線粒體移植入人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能有效地加劇輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞核DNA 損傷，通過(guò)對(duì)mtDNA缺失的細(xì)胞模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)移植的外源線粒體能夠在增強(qiáng)X線損傷腫瘤細(xì)胞核DNA 的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[24]。

4 問(wèn)題與展望

隨著研究的深入，對(duì)線粒體的認(rèn)識(shí)已經(jīng)不局限于產(chǎn)生能量維持細(xì)胞功能，在清除自由基，延緩衰老，促進(jìn)代謝方面的作用也逐漸得到重視，但機(jī)制還不明確。線粒體移植為許多疾病開(kāi)辟了新的視野，相關(guān)的動(dòng)物模型和臨床研究還有待完善。線粒體功能障礙威脅細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，干擾能量生產(chǎn)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和疾病。為了治療更多的患者，強(qiáng)烈需要相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)以擴(kuò)大線粒體移植治療的使用范圍。