人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶線粒體轉(zhuǎn)位的研究進(jìn)展

胡惟愷，劉瑞霞，陰赪宏*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 1.內(nèi)科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100026)

人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transciptase，hTERT)是人端粒酶的催化亞單位和限速酶，主要表達(dá)在細(xì)胞核中，對(duì)維持端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度具有關(guān)鍵作用，在細(xì)胞生存、轉(zhuǎn)化、分化、維持線粒體功能以及DNA損傷氧化應(yīng)激時(shí)核基因的表達(dá)等方面也發(fā)揮重要作用[1]。近年來(lái)研究顯示在耐藥細(xì)胞或接受氧化應(yīng)激刺激的細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)(主要是線粒體)hTERT的表達(dá)較正常細(xì)胞顯著增加[2]。

hTERT從細(xì)胞核內(nèi)穿過(guò)核孔移入線粒體，使得線粒體內(nèi)hTERT表達(dá)增加，稱為hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位，該過(guò)程可逆[3]。線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞有氧呼吸和氧化磷酸化的場(chǎng)所，線粒體內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)為線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈副產(chǎn)物，其來(lái)源主要在線粒體內(nèi)。hTERT通過(guò)核孔從核內(nèi)移出至線粒體內(nèi)膜，與線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)非特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈功能，ROS生成減少，減輕mtDNA損傷，保護(hù)線粒體功能，輔助細(xì)胞抗凋亡[1，4]。hTERT線粒體轉(zhuǎn)位在細(xì)胞凋亡中的作用可能為雙向的，且還與細(xì)胞永生化和細(xì)胞耐藥相關(guān)。本文就hTERT的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控，hTERT線粒體轉(zhuǎn)位過(guò)程及影響因素，線粒體內(nèi)hTERT的生物學(xué)功能等相關(guān)研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1 hTERT的表達(dá)和調(diào)控

hTERT基因組DNA長(zhǎng)37 kb，其中33 kb是內(nèi)含子序列，其余4 kb與hTERT mRNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)。hTERT蛋白在大部分體細(xì)胞中不表達(dá)或少量表達(dá)，在生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，正常條件下，細(xì)胞內(nèi)hTERT大部分位于細(xì)胞核，僅20%～30%位于細(xì)胞質(zhì)(包括線粒體)[5]。hTERT蛋白的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄、RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA降解、翻譯等水平的調(diào)控，其中主要是轉(zhuǎn)錄水平。

調(diào)控hTERT轉(zhuǎn)錄的因素主要包括原癌基因、轉(zhuǎn)錄因子。位于第8號(hào)染色體的原癌基因c-myc本身或與異二聚體MAX形成復(fù)合物后結(jié)合hTERT啟動(dòng)子序列中的E盒，上調(diào) hTERT的轉(zhuǎn)錄活性[6]。ETS原癌基因2可與c-myc相互作用，共同與hTERT啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，而巨噬細(xì)胞集落刺激因子1受體則可促進(jìn)c-myc與hTERT啟動(dòng)子的結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[7]。核因子κB(NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，可與啟動(dòng)子結(jié)合或通過(guò)影響hTERT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)起激活轉(zhuǎn)錄的作用[7]。轉(zhuǎn)錄因子刺激蛋白1(Sp1)在胎兒、精子、造血干細(xì)胞中高表達(dá)，與hTERT啟動(dòng)子上的GC盒結(jié)合而增強(qiáng)hTERT轉(zhuǎn)錄活性[8]。雌激素受體陽(yáng)性細(xì)胞中的雌二醇(E2)。正常細(xì)胞和端粒酶陰性永生細(xì)胞系中的曲古霉素 A(Ⅰ和Ⅱ類組蛋白脫乙酰酶的抑制劑)可促進(jìn)hTERT的轉(zhuǎn)錄[9-10]。轉(zhuǎn)錄因子Mad1通過(guò)與異二聚體MAX形成復(fù)合物，再與E盒結(jié)合，抑制hTERT的表達(dá)；而腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子E2F1通過(guò)與hTERT啟動(dòng)子區(qū)域E2識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)c-myc誘導(dǎo)hTERT表達(dá)進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)控來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄[7-8]。p53可能通過(guò)抑制Sp1結(jié)合到hTERT基因啟動(dòng)子上而實(shí)現(xiàn)對(duì)hTERT基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用[8]。HeLa細(xì)胞內(nèi)的復(fù)合體5c、復(fù)合體8b可抑制hTERT基因啟動(dòng)子的活性，減少轉(zhuǎn)錄[11]。WTl可直接與hTERT基因啟動(dòng)子發(fā)生作用抑制hTERT基因轉(zhuǎn)錄[6]。此外，研究顯示microRNA可以通過(guò)調(diào)控hTERT的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)間接調(diào)控hTERT表達(dá)，如miR-494和miR-1294下調(diào)c-myc[6]。部分轉(zhuǎn)錄因子對(duì)hTERT轉(zhuǎn)錄具有雙重作用。上游刺激因子蛋白屬于基本的螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈家族蛋白，其中的1/2異二聚體可直接與端粒酶陽(yáng)性和陰性細(xì)胞中hTERT近端啟動(dòng)子上的E盒結(jié)合在調(diào)節(jié)hTERT基因表達(dá)中起激活和抑制作用。AP-1、早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白-1、低氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)等也存在雙重作用[7]。

RNA加工水平的調(diào)控主要為剪接。當(dāng)剪接發(fā)生在兩個(gè)內(nèi)含子之間時(shí)，會(huì)刪除兩個(gè)內(nèi)含子及其中間的全部外顯子或內(nèi)含子，稱為RNA的可變剪接。已知有22種hTERT mRNA的可變剪接，任何一部分基因的缺失均會(huì)導(dǎo)致無(wú)功能性剪接變異體的產(chǎn)生；僅兩種無(wú)缺失mRNA的剪接變異體具有催化作用，構(gòu)成有功能的hTERT mRNA[12-13]。以下兩種為較常見(jiàn)的可變剪接體，外顯子7和8上182個(gè)核苷酸的缺失(α+β-變異體)，基因外顯子6上的36個(gè)核苷酸的剪切使得部分蛋白分子上的反轉(zhuǎn)錄酶A區(qū)缺失(α-β+變異體)并失去催化作用；無(wú)功能性hTERT的產(chǎn)生是對(duì)hTERT負(fù)性調(diào)控的一種方式[13-14]。研究顯示凋亡性核酸內(nèi)切酶(apoptotic endonuclease，EndoG)在細(xì)胞內(nèi)的分布和hTERT相同；改變EndoG的表達(dá)水平及定位，hTERT mRNA可變剪接體的表達(dá)水平和定位也相應(yīng)改變，因此認(rèn)為EndoG的過(guò)表達(dá)參與hTERT mRNA的可變剪接[13]。正常情況下，EndoG位于線粒體內(nèi)；在凋亡細(xì)胞或DNA受損的細(xì)胞中，EndoG移入核內(nèi),線粒體內(nèi)EndoG減少，核內(nèi)EndoG增加，核內(nèi)進(jìn)行hTERT mRNA的可變剪接[15]；CD4+T細(xì)胞中EndoG的過(guò)表達(dá)，使有功能的hTERT可變剪接體的表達(dá)下調(diào)，無(wú)功能的可變剪接變體表達(dá)上調(diào)。以上因素造成有活性α+β+hTERT mRNA可變剪接體數(shù)量減少，而無(wú)活性的α+β-hTERT mRNA可變剪接體數(shù)量增加，兩種mRNA剪接體比例的改變導(dǎo)致端粒酶活性受抑制[16]。

miRNA和hTERT啟動(dòng)子甲基化均與hTERT表達(dá)減弱相關(guān)。miRNA(miR-138、491-5p、1266、1207-5p、1182等)可通過(guò)結(jié)合于hTERT 3′UTR上的互補(bǔ)序列而干擾hTERT mRNA的正常翻譯，抑制hTERT表達(dá)[17]。研究顯示hTERT啟動(dòng)子內(nèi)特定區(qū)域的甲基化，特別是hTERT核心啟動(dòng)子上游的甲基化與基因激活有關(guān)，但其他基因的啟動(dòng)子甲基化通常與基因沉默相關(guān)[6]。線粒體內(nèi)不包含hTERT相關(guān)基因和蛋白，轉(zhuǎn)錄和翻譯均不在線粒體內(nèi)進(jìn)行，因此線粒體內(nèi)的hTERT表達(dá)是通過(guò)線粒體轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)的。

2 hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位

細(xì)胞質(zhì)中有少量hTERT表達(dá)，主要位于線粒體內(nèi)，但線粒體內(nèi)不包含hTERT相關(guān)基因，因此線粒體hTERT是通過(guò)線粒體轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)的。

hTERT蛋白具有核定位和線粒體定位功能。hTERT的C端多肽(27 ku)可在端粒酶的作用下進(jìn)行核轉(zhuǎn)位或者染色體尾端定位；TERT的N端則是線粒體定位信號(hào),N端的線粒體定位肽通過(guò)與線粒體膜上的出入轉(zhuǎn)位酶結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)位[6,18]。氧化應(yīng)激條件下，hTERT線粒體轉(zhuǎn)位的起始因子(Tyr707)磷酸化[4]，hTERT在定位信號(hào)肽的作用下主動(dòng)發(fā)生核外移，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，在線粒體膜上的線粒體外膜異位酶(translocase of the outer mitochon-drial membrane member,TOM)、線粒體內(nèi)膜異位酶(translocase of the inner mitochondrial membrane，TIM)及TERT的線粒體定位肽的作用下，TERT結(jié)合到mtDNA的編碼區(qū)ND1和ND2(編碼呼吸鏈復(fù)合體I的亞基)并保護(hù)這兩組基因，輔助編碼線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的亞基，增加功能性復(fù)合物I亞基的合成，提高復(fù)合體I的呼吸效率，減少ROS生成[5-6]。研究[19]發(fā)現(xiàn)核外移過(guò)程中，信號(hào)蛋白14-3-3綁定于TERT上，使TERT定位于細(xì)胞核，當(dāng)14-3-3蛋白表達(dá)陰性時(shí)，TERT從細(xì)胞核移出。酪氨酸磷酸酶Shp-2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，核內(nèi)Shp-2錨定Tyr707，抑制Tyr707活性，從而抑制hTERT線粒體轉(zhuǎn)位；內(nèi)皮細(xì)胞中核內(nèi)Shp-2可與TERT結(jié)合，并在TERT核外移之前分離；當(dāng)Shp-2下調(diào)時(shí)，線粒體內(nèi)TERT表達(dá)上調(diào)[20-21]。

另有研究[6]顯示部分哺乳動(dòng)物TERT以線粒體膜電位依賴的方式導(dǎo)入線粒體基質(zhì)。制備與蛋白質(zhì)a(非線粒體伴隨蛋白且單獨(dú)不能進(jìn)入線粒體)相連的嵌合結(jié)構(gòu)hTERT N33 PrA(hTERT的前33個(gè)N端氨基酸，包括線粒體定位信號(hào))，將hTERT N33 PrA與線粒體共同孵育后進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示進(jìn)入線粒體的hTERT N33 PrA沒(méi)有分子質(zhì)量的改變，表明hTERT上沒(méi)有可切割的線粒體定位信號(hào)，其進(jìn)入線粒體的過(guò)程依賴于線粒體膜電位；而當(dāng)無(wú)膜電位時(shí)，嵌合蛋白可與線粒體外膜結(jié)合，但無(wú)法進(jìn)入線粒體。

3 hTERT線粒體轉(zhuǎn)位的功能

線粒體內(nèi)TERT作為一種不依賴端粒酶RNA的反轉(zhuǎn)錄酶起作用，在hTERT過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，hTERT線粒體轉(zhuǎn)位增多，轉(zhuǎn)位后定位于線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)，非特異性地與mtDNA的各個(gè)區(qū)域(包括12S和16S rRNA，ND1、2、4和5，COX Ⅰ和Ⅲ，以及ATP合酶的6和8亞基)結(jié)合，參與mtDNA代謝，提高線粒體膜電位[6]；hTERT線粒體轉(zhuǎn)位還可增加細(xì)胞內(nèi)還原型和氧化型谷胱甘肽的比例，增強(qiáng)抗氧化功能，也可增加細(xì)胞色素C氧化酶(線粒體電子傳輸鏈中的限速酶)活性[22]，最終減少ROS生成，保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損傷，減少mtDNA損傷[1，4]。hTERT還特異性地與14種mtDNA編碼的tRNA相互作用，所有與hTERT相互作用的RNA均與mtDNA復(fù)制相關(guān)，因此推測(cè)TERT可能參與mtDNA雙鏈斷裂修復(fù)[4-5]。細(xì)胞水平研究表明干擾hTERT的線粒體定位功能但保持其核內(nèi)端粒酶的功能，hTERT表達(dá)后不能進(jìn)入線粒體，卻仍可在核內(nèi)發(fā)揮功能,使得mtDNA完整性缺失，mtROS增加并改變了線粒體超微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞出現(xiàn)線粒體功能缺陷[6]。易患癌的小鼠模型中，TERT敲除小鼠全部死于線粒體功能障礙和端粒缺失[23]，表明TERT對(duì)線粒體具有保護(hù)作用；同樣，在TERT敲除的HUVEC細(xì)胞以及TERT敲除小鼠的心臟中，也發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)TERT對(duì)線粒體功能的保護(hù)作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)人臍帶血單核細(xì)胞的線粒體hTERT在氧化應(yīng)激時(shí)增多可以保護(hù)新生兒的mtDNA免受妊娠期糖尿病的氧化損傷[24]。hTERT線粒體轉(zhuǎn)位還可能與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞永生化和細(xì)胞耐藥相關(guān)。

hTERT線粒體轉(zhuǎn)位在細(xì)胞凋亡中可能存在雙重作用，既有對(duì)細(xì)胞的保護(hù)，防止細(xì)胞凋亡，也可導(dǎo)致細(xì)胞損傷。hTERT線粒體轉(zhuǎn)位后與mtDNA結(jié)合，減少mtDNA損傷，同時(shí)增強(qiáng)抗氧化功能，減少ROS生成，保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損傷，輔助抗凋亡。研究結(jié)果顯示hTERT線粒體轉(zhuǎn)位對(duì)細(xì)胞有損傷作用。有研究[25]證實(shí)，經(jīng)過(guò)氧化氫處理的正常細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)水平與mtDNA損傷呈正相關(guān)；經(jīng)過(guò)氧化氫處理的hTERT突變細(xì)胞(hTERT的N端線粒體前導(dǎo)序列突變，使線粒體轉(zhuǎn)位功能喪失，但保持催化活性)中，過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的mtDNA損傷顯著減少，且未見(jiàn)細(xì)胞活性或細(xì)胞生長(zhǎng)受損，表明hTERT線粒體轉(zhuǎn)位缺失有助于細(xì)胞的抗凋亡活性，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡，減少mtDNA損傷。認(rèn)為可能是由于線粒體基因組對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，致使過(guò)氧化氫在mtDNA中誘導(dǎo)的損傷比在核基因組中更多；而hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位使細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的mtDNA損傷更敏感并導(dǎo)致細(xì)胞死亡；無(wú)hTERT線粒體轉(zhuǎn)位時(shí)，則出現(xiàn)mtDNA損傷減少、細(xì)胞存活率增加、防止細(xì)胞凋亡的情況。有研究[26]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的CAD和非CAD受試者心房及脂肪微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，線粒體TERT上調(diào)能清除內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS，減少DNA損傷。此外，有研究[27]證實(shí)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，線粒體內(nèi)hTERT可引起細(xì)胞器受損，受損細(xì)胞器累積后引起細(xì)胞自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同樣支持上述觀點(diǎn)。

細(xì)胞永生化導(dǎo)致癌癥的關(guān)鍵在于直接或間接調(diào)控hTERT啟動(dòng)子，使hTERT重新激活，但抑制hTERT出核可阻止細(xì)胞永生化，增加細(xì)胞對(duì)毒性藥物的敏感性[28]，因此認(rèn)為hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位可能參與細(xì)胞永生化。

hTERT線粒體轉(zhuǎn)位還可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。hTERT在細(xì)胞核內(nèi)作為反轉(zhuǎn)錄酶，調(diào)節(jié)端粒酶活性，維持端粒長(zhǎng)度，參與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，而hTERT在線粒體內(nèi)則與細(xì)胞耐藥相關(guān)。大多數(shù)抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制是產(chǎn)生ROS，引起過(guò)量DNA損傷和凋亡，若持續(xù)使用相同藥物治療同一惡性腫瘤可能會(huì)使ROS產(chǎn)生率減低，導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。而hTERT線粒體轉(zhuǎn)位致使線粒體內(nèi)hTERT過(guò)表達(dá)，調(diào)節(jié)呼吸鏈功能，減少ROS產(chǎn)生，抑制ROS誘導(dǎo)的損傷，減少mtDNA損傷，細(xì)胞耐受能力增強(qiáng)，減少凋亡的發(fā)生[2]。因此，hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位可能作為一個(gè)潛在的多藥耐藥機(jī)制。

4 小結(jié)

氧化應(yīng)激時(shí)，hTERT在定位肽的作用下核外移，再與線粒體膜上的轉(zhuǎn)位酶結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)位，減少ROS生成，減少氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)mtDNA，但hTERT的線粒體輸出途徑尚未明確。線粒體內(nèi)hTERT可能參與細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡、永生化和細(xì)胞耐藥過(guò)程，機(jī)制未明。線粒體內(nèi)hTERT還可能與癌癥(如肝癌、胰腺癌、頭頸部癌等)、冠脈疾病等相關(guān)。利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)干擾或改變hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位過(guò)程，進(jìn)一步明確hTERT轉(zhuǎn)位的生物學(xué)功能以及與某些疾病的關(guān)系可能成為未來(lái)研究的方向。