辛伐他汀通過MEK/ERK信號轉導通路上調突觸素表達

于成璐, 呂 濤 , 孟慶貴, 萬里姝

(遼寧省丹東市第一醫(yī)院, 1.神經內科, 2.眼科, 遼寧 丹東, 118000)

神經元回路受損與神經元結構、功能的改變密切相關，受損的神經元回路會導致一系列神經發(fā)育性疾病。突觸素(SYP)作為突觸前膜的特異性標志蛋白，能夠參與突觸發(fā)生、突觸囊泡轉運并介導突觸信號，對神經遞質的釋放過程也起到積極的調節(jié)作用，對保持神經元的正常生理功能具有重要的意義[1]。1986年, COULOMBE P等[2]提出的經典信號通路絲裂原活化蛋白激酶-細胞外調節(jié)蛋白激酶(MAPK-ERK)途徑，其主要調節(jié)、控制細胞多種生理反應，對學習記憶功能有重要的調控作用。細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)通路主要途徑包括Ras/Raf/MEK/ERK, 絲裂原活化蛋白激酶(MEK)是ERK上游的關鍵蛋白，其主要作用之一是磷酸化激活其下游底物ERK。MEK/ERK這條經典的信號轉導通路在細胞的生長、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮著十分重要的作用，例如神經元突起的形成及發(fā)育，包括樹突、軸突以及神經元極性的形成等[3-4]。ERK被激活后能夠參與維持神經元樹枝狀及其形態(tài)[5]。有關大鼠皮層神經細胞的實驗[6-7]發(fā)現(xiàn)，激活MEK/ERK信號通路能夠促進缺氧損傷的大鼠神經細胞存活。辛伐他汀[8-10](SV)是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有較好的調節(jié)血脂的作用，并具有神經保護功能。本實驗采用體外培養(yǎng)新生乳鼠大腦皮層神經元，觀察SV對SYP表達的影響，分析SV對神經元SYP促進作用的信號傳導機制，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SV購自杭州默沙東制藥有限公司，批號 N1001; 新生胎牛血清、馬血清購自杭州四季青工程材料有限公司; DMEM、F12培養(yǎng)基購自Invitrogen公司; 胰蛋白酶、L-多聚賴氨酸、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司; 阿糖胞苷為意大利S.P.A公司產品; MEK/ERK阻斷劑PD98059和磷酸化MEK(p-MEK)、磷酸化ERK1(p-ERK1)和磷酸化ERK2(p-ERK2)鼠屬單克隆抗體購自CELL Signaling公司; 鼠SYP單克隆抗體購自Santa Cruz公司; 山羊抗小鼠IgG二抗、HRP辣根過氧化物酶標記購自Abbkine。

1.2 皮層神經元培養(yǎng)

將出生24 h內的新生大鼠置于75%酒精浸泡消毒，在無菌條件下取大腦皮層放入盛有F12的培養(yǎng)基中剝離腦膜，用PBS沖洗1遍。將大腦皮層剪碎為1 mm3的組織塊，加入0.125%胰蛋白酶在37 ℃消化10 min。消化后的細胞呈離散狀，加入10%胎牛血清2～3滴停止消化。200目篩網過濾, 1 000×g離心10 min, 去上清。將一定量的10%馬血清、10%胎牛血清、F12、DMEM配制成細胞懸液，調整細胞密度為(1×105～1×106)/mL, 接種于培養(yǎng)板中，置入37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)2 d后，加入一定濃度的阿糖胞苷以抑制膠質細胞增殖，重新更換培養(yǎng)基。此后每3 d半量換液1次，細胞培養(yǎng)4 d后用于實驗。應用兔抗神經元特異性稀醇化酶(NSE)和NF200抗體進行免疫熒光染色鑒定，結果顯示神經元培養(yǎng)純度在90%以上。

1.3 細胞分組及處理

實驗分為對照組、不同濃度SV處理組、PD98059處理組、SV+PD98059處理組。對照組: 加入等量培養(yǎng)基; SV處理組: 培養(yǎng)4 d的神經元分別加入不同濃度(2、4、8 μmol/L)SV作用48 h; PD98059處理組: 培養(yǎng)4 d的神經元加入10 μmol/L阻斷劑PD98059作用48 h; SV+PD98059處理組: 先加入10 μmol/L阻斷劑PD98059作用30 min, 再加入10 μmol/L SV共同作用48 h。

1.4 SYP免疫熒光染色

細胞培養(yǎng)7 d后棄掉培養(yǎng)基, PBS清洗3次; 室溫下用新配制的4%多聚甲醛固定25 min, PBS清洗3次; 室溫下浸入含0.1% Triton X-100的PBS中通透30 min, PBS清洗2次; 采用含0.1% BSA的PBS于室溫下封閉60 min; 加入SYP抗體(1∶100)4 ℃過夜。室溫放置60 min, PBS沖洗3次; 加入紅棕色羅丹明溶液標記的二抗(1∶100)室溫作用60 min, 避光PBS沖洗3次; 50%甘油封片。倒置熒光顯微鏡下檢測SYP表達水平。

1.5 SYP、p-MEK、p-ERK1和p-ERK2的Western blot 分析

采用BCA法測定蛋白質含量，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE凝膠中蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉。放入SYP、p-MEK、p-ERK1和p-ERK2的一抗中(1∶500)4 ℃雜交過夜。將PVDF膜經TBST漂洗3次后放入鼠二抗(1∶500)孵育1～2 h。取出PVDF膜，TBST沖洗后，吸去多余液體，鋪于玻璃板上。將ECL試劑盒內的detection reagent 1與detection reagent 2等體積混合后，均勻滴在PVDF膜上，反應1～2 min?；瘜W發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀顯示、拍照，采用Visionworks 6.3.3.圖像采集及分析軟件對蛋白條帶光密度進行分析。實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 SV增強皮層神經元SYP免疫反應性

免疫熒光檢測顯示，在對照組大鼠大腦皮層神經元中, SYP表達呈散點狀，點狀細小顆粒連接成細絲，熒光強度較弱; 經4 μmol/L SV處理48 h的神經元SYP表達明顯增多，散狀點小顆粒相互連接成絲，細絲交織在一起呈網狀分布，熒光強度明顯增加。見圖1。

A: 對照組神經元SYP表達; B: 4 μmol/L SV處理48 h的神經元SYP表達。

2.2 SV濃度依賴性上調皮層神經元SYP水平

對加入不同濃度(2、4、8 μmol/L)SV培養(yǎng)4 d的大鼠皮層神經元進行Western blot檢測顯示，作用48 h后可顯著增高SYP表達水平，并呈濃度依賴性，即8 μmol/L SV對SYP的增高作用最為顯著。見圖2、表1。

1: 對照組; 2: SV 2 μmol/L; 3: SV 4 μmol/L;4: SV 8 μmol/L。

表1 不同濃度SV對大鼠皮層神經元SYP水平的影響

2.3 阻斷MEK/ERK信號通路抑制SV對SYP的上調

Western blot檢測顯示, 8 μmol/L SV處理可顯著增高大鼠皮層神經元內SYP水平; 在8 μmol/L SV處理的神經元中應用MEK和ERK的特異性阻斷劑PD98059處理，可減少SV引起的SYP水平增高，但在未用SV處理的神經元中單獨應用PD98059并不能使SYP水平降低。由此可見, SV可能是通過MEK/ERK信號通路上調SYP水平。見圖3、表2。

1: 對照組; 2: SV處理組; 3: SV+PD98059處理組;4: PD98059處理組。

表2 PD98059對各組皮層神經元中SYP水平的影響

2.4 阻斷MEK/ERK信號通路抑制SV對MEK、ERK1和ERK2磷酸化的上調

Western blot檢測顯示, 8 μmol/L SV處理可顯著增高大鼠皮層神經元中p-MEK、p-ERK1和p-ERK2水平; PD98059可抑制SV引起的p-MEK、p-ERK1和p-ERK2水平增高; 單獨應用PD98059對p-MEK和p-MEK2蛋白表達水平無影響，但可降低p-ERK1水平。由此可見, SV對神經元SYP蛋白表達的促進作用可能與MEK/ERK介導的p-MEK、p-ERK1和p-ERK2上調有關。

1: 對照組; 2: SV處理組; 3: SV+PD98059處理組;4: PD98059處理組。

3 討 論

神經退行性疾病患者腦內前皮質中突觸蛋白水平的降低程度比其他大腦區(qū)域更為嚴重，此區(qū)域與推理、計劃和抽象思考等重要大腦功能密切相關[11-12]。突觸蛋白是一組與突觸相關的具有神經元特異性的磷酸蛋白，主要分布于神經終末處, SYP主要特異性地分布于突觸前囊泡膜上，參與突觸后信號轉導，在突觸可塑性等方面發(fā)揮重要作用。研究[7]報道, SYP是突觸蛋白家族中最先出現(xiàn)在培養(yǎng)體外皮層神經元生長階段并呈高水平表達。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路主要包括3大類，分別是MAPK kinase kinase(MAPKKK)、MAPK kinase(MAPKK)和MAPK, 這3大類MAPK級聯(lián)反應在哺乳動物應激信號轉導中與各類上游信號及級聯(lián)過程的酶共同作用[13]。MAPK/ERK 信號轉導通路即Ras/Raf/ERK1/2信號通路，與多種疾病密切相關，激活的Ras可以募集并激活下游相應的激酶，如MAP/ERK激酶、Raf和 ERK等，最終調節(jié)控制細胞的各種反應[8]。MEK和ERK均分為2個亞型，即MEK1、MEK2和ERK1、ERK2。MEK待蘇氨酸殘基被其磷酸化后，可進一步激活其下游底物ERK。MEK1/2和ERK1/2均是MEK/ERK信號通路中重要的激酶蛋白。MEK被上游相應激酶磷酸化后活化，然后再次磷酸化后活化其下游激酶ERK[14-15]，表明磷酸化是信號轉導通路活化作用不可缺少的重要因素[16]。ERK活化后進入到細胞核內，進一步誘導產生各種生物學效應，包括細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡等[9-12]。研究[17]證實，ERK信號通路與腦內長時程增強(LTP)的形成以及學習記憶功能有密切聯(lián)系。研究[18]報道在交感神經細胞中，磷酸化的ERK1/2具有保護效應，可促進大鼠神經細胞軸突存活; 在海馬神經元中, ERK能夠被其上游激酶MEK激活，與神經元突觸可塑性如學習、記憶及生物學反應有關。

表3 PD98059對各組皮層神經元中p-MEK、p-ERK1和p-ERK2水平的影響

本實驗應用SV處理皮層神經元，免疫熒光顯示SV能明顯促進SYP表達, Western blot半定量進一步證明了這種促進作用，并呈一定劑量依賴性。ERK的抑制劑PD98059不僅能抑制ERK, 也能抑制MEK, 從而抑制ERK的功能[8-9]。作者應用MEK/ERK的阻斷劑PD98059抑制ERK及MEK, 結果顯示PD98059可明顯阻斷SV引起的SYP水平上調，說明SV的促進作用與MEK/ERK信號通路有關。ERK 的激活參與維持神經元樹枝狀的形態(tài)[4], 作者進一步檢測了MEK/ERK下游的2個蛋白磷酸化水平，并應用PD98059阻斷MEK/ERK信號通路，結果發(fā)現(xiàn)SV同樣可以對抗PD98059所致的p-MEK、p-ERK1和p-ERK2表達的減少。上述結果提示, SV通過MEK/ERK信號轉導上調SYP表達。ERK信號通路能夠調節(jié)細胞的生長、分化及存活。體外實驗[13-15]發(fā)現(xiàn), ERK能夠通過調控神經突觸相關功能蛋白，參與海馬神經細胞新樹突棘的生成，提示ERK可能參與神經元形態(tài)改變過程。MEK/ERK通路對機械性外傷損傷所致的神經元凋亡具有保護作用, PI3K/AKT和ERK通路的活化均參與抵抗神經酰胺誘導的皮層神經元凋亡[19-20]。本實驗也發(fā)現(xiàn)SV通過ERK信號通路促進SYP表達，進而促進細胞生長發(fā)育，與劉紅兵等[13]研究結果一致。研究[14-15]表明, MEK/ERK阻斷劑U0126通過抑制ERK1/2的激活，進而能夠抑制谷氨酸引起的神經元損傷，多巴胺引起的神經元死亡也與ERK1/2有關[16]。由此可見, ERK1/2在神經元的生長發(fā)育過程中也可能具有促進細胞死亡的作用。

綜上所述, SV能激活MEK/ERK信號轉導通路，上調SYP、p-MEK、p-ERK1和p-ERK2蛋白表達水平，并能對抗阻斷劑導致的蛋白表達下降。研究[21]表示持續(xù)的ERK信號激活會促使細胞凋亡，而短暫的ERK信號激活則能夠促使細胞存活，可見MEK/ERK信號轉導通路對神經元的作用具有多向性，其相關機制還有待進一步研究。