敲減miR-9抑制肺非小細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和遷移

古衛(wèi)權(quán)，楊 劼，肖 葉，楊勝利，葉 俊，王 飛，羅靈均，張小文，趙 寧

(佛山市第一人民醫(yī)院胸外科，廣東 佛山 528000)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率占惡性腫瘤死亡原因首位，是對人類健康威脅最大的惡性腫瘤[1]。人非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌，約占所有肺癌的80%[2]，但其發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制尚不完全清楚。

MicroRNAs(miRNAs，miRs)是小的非編碼RNA，主要與靶基因的3′-UTR結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。miRs已被證明在一系列惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移[4-5]。miR-9是miRs家族重要的成員之一，其在膠質(zhì)瘤、喉癌、乳腺癌等多種人類腫瘤中發(fā)揮促癌作用[6-8]，而miR-9在NSCLC中的作用及其機(jī)制并不完全清楚。因此，本文通過RT-qPCR法研究NSCLC組織和NSCLC細(xì)胞中miR-9的表達(dá)情況，通過CCK-8和Transwell法研究抑制其表達(dá)對NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，并分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa Bio公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒、CCK-8試劑盒、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；miR-9-mimic、miR-9 inhibitor和陰性對照(miR-NC)、si-TET2和陰性對照(si-NC)由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成；DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑和Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；TET2抗體購自美國Abcam公司。

1.2 臨床樣本獲取

收集46例NSCLC患者(15例T1期、15例T2期和16例T3+T4期)的NSCLC組織和癌旁組織。所有樣本采集于佛山市第一人民醫(yī)院胸外科(2018年11月至2019年11月)行NSCLC切除術(shù)患者，且所有患者均已做臨床和病理診斷，樣本獲取后快速儲存于-80 ℃冰箱。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)(No.fsykyll-lc-20181106)，且所有患者在術(shù)前均對本研究知情同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)以及NSCLC細(xì)胞株A549和NCI-H1299均購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。細(xì)胞接種于添加10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。

1.4 RT-qPCR

用TRIzol試劑從NSCLC組織、癌旁組織、BEAS-2B細(xì)胞以及NSCLC細(xì)胞株中提取總RNA?？俁NA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，每樣品取2 μg總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取各樣本cDNA、miR-9引物和U6引物按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR試劑盒說明書步驟，在ABI-7300 PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)程序設(shè)置為95 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃變性15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 2 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)。引物序列為：miR-9正向引物 5′-CAGAGAAG-GGCAGTGGAGAC-3′和反向引物 5′-ACGACA-GAGACCGAAAAAGG-3′；U6正向引物 5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′和反向引物 5′-AACGC-TTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-9相對表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor

分別取A549和NCI-H1299細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，用無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)基同步化6 h，然后根據(jù)制造商說明書步驟，用Lipofectamine 2000預(yù)配制的含30 nmol·L-1miR-9-inhibitor或miR-NC的混懸液分別加入細(xì)胞，并用無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)基孵育6 h，然后更換含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

收集已轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor或miR-NC的A549和NCI-H1299細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞方案接種于96孔板，并在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞孵育箱分別培養(yǎng)1、2、3和4 d。分別在培養(yǎng)時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8溶液并孵育3 h，隨后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

收集已轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor或miR-NC的A549和NCI-H1299細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)·mL-1。取100 μL細(xì)胞懸液分別加入Transwell上室面(用于檢測細(xì)胞遷移)或Matrigel包被Transwell上室面(用于檢測細(xì)胞侵襲)，將600 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基加入下室。37 ℃培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定上室面細(xì)胞30 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡

通過RIPA裂解液提取組織或細(xì)胞中全蛋白，每樣品取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜。分別采用一抗TET2(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗1 h。用TBST洗滌后，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Quantity One 軟件分析條帶的灰度值。

1.9 雙熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)

TargetScan 7.2在線軟件(http://www.targetscan.org/vert_72/)顯示TET2 3′-UTR存在miR-9結(jié)合位點(diǎn)。由廣州銳博生物技術(shù)有限公司對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變并構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因pGL3-TET2 3′-UTR野生型(WT)或突變型(MUT)質(zhì)粒。取已轉(zhuǎn)染miR-9-mimic或miR-NC的A549細(xì)胞，再用Lipofectamin 2000分別將pGL3-TET2 WT或MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶基因檢測試劑盒說明書步驟，分別加入PLB裂解液，提取蛋白上清液，并將上清液轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板，加入反應(yīng)底物后，利用Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.10 轉(zhuǎn)染si-TET2和Transwell實(shí)驗(yàn)

取已轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor或miR-NC的A549細(xì)胞，用Lipofectamin 2000分別將30 nmol·L-1si-NC或si-TET2分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。收集已轉(zhuǎn)染miR-NC+si-NC、miR-9-inhibitor+si-NC和miR-9-inhibitor+si-TET2的細(xì)胞，用Transwell法檢測細(xì)胞遷移與侵襲(檢測方法同1.7 Transwell實(shí)驗(yàn))。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-9在各期NSCLC組織和NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)情況

用RT-qPCR檢測癌旁組織和NSCLC組織中miR-9表達(dá)情況，結(jié)果(圖1A)顯示：與癌旁組織[(100.24±18.46)%]相比，miR-9在NSCLC組織中相對表達(dá)水平[(656.49±29.15)%]明顯升高(P<0.001)。用RT-qPCR檢測不同T分期的NSCLC組織中miR-9表達(dá)情況，結(jié)果(圖1B)顯示：與T1期NSCLC組織[(102.36±4.52)%]相比，miR-9在T2期[(186.52±7.15)%]和T3+T4期[(323.24±12.34)%]NSCLC組織中相對表達(dá)水平明顯升高(P<0.01或P<0.001)。用RT-qPCR檢測人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)和NSCLC細(xì)胞株(A549和NCI-H1299)中miR-9表達(dá)情況，結(jié)果(圖1C)顯示：與BEAS-2B[(98.75±28.76)%]相比，miR-9在A549[(626.24±22.13)%]和NCI-H1299[(641.56±21.39)%]細(xì)胞中相對表達(dá)水平明顯升高(均P<0.001)。

A：NSCLC組織和癌旁組織中miR-9的相對表達(dá)水平,n=46；B：不同T分期(T1期n=15，T2期n=15，T3+T4期n=16)的NSCLC組織中miR-9的相對表達(dá)水平；C：BEAS-2B、A549和NCI-H1299細(xì)胞中miR-9的相對表達(dá)水平，n=3。**P<0.01,***P<0.001與癌旁組織、T1期NSCLC組織或BEAS-2B細(xì)胞比較。

2.2 敲減miR-9對NSCLC細(xì)胞增殖以及轉(zhuǎn)移能力的影響

CCK-8結(jié)果(圖2A)顯示：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC后1～4 d的OD值分別為0.46±0.03、0.71±0.01、1.07±0.06和1.52±0.04，轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor 后1～4 d的OD值分別為0.40±0.03、0.45±0.04、0.62±0.04和0.87±0.02；NCI-H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC后1～4 d的OD值分別為0.41±0.07、0.52±0.03、0.97±0.06和1.46±0.05，轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor后1～4 d的OD值分別為0.35±0.03、0.39±0.02、0.48±0.0和0.56±0.04；相比于轉(zhuǎn)染miR-NC細(xì)胞，A549細(xì)胞和NCI-H1299細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor后2～4 d的細(xì)胞活性均降低(P<0.05)。Transwell結(jié)果(圖2B—C)顯示：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC和轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor后的遷移細(xì)胞數(shù)分別為(252±18)和(85±29)個(gè)、侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(201±11)和(56±15)個(gè)；NCI-H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC和轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor后的遷移細(xì)胞數(shù)分別為(175±21)和(42±13)個(gè)、侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(134±12)和(42±6)個(gè)；相比于轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞，A549細(xì)胞(圖2B)和NCI-H1229(圖2C)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor后的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.01或P<0.001)。

A：CCK-8檢測A549和NCI-H1299細(xì)胞的細(xì)胞活性；B：Transwell檢測A549細(xì)胞的侵襲與遷移；C：Transwell檢測NCI-H1229細(xì)胞的侵襲與遷移。**P<0.01、***P<0.001與miR-NC組比較,n=4。

2.3 miR-9靶基因驗(yàn)證

Western blot結(jié)果(圖3A)顯示：與BEAS-2B細(xì)胞[(101.25±8.46)%]相比，TET2在A549[(21.34±3.37)%]和NCI-H1229[(26.59±2.13)%]細(xì)胞中相對表達(dá)水平均明顯降低(P<0.001)。TargetScan在線軟件顯示TET2 3′-UTR存在miR-9結(jié)合位點(diǎn)(圖3B)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果(圖3B)顯示：相對于miR-NC+WT組[(98.56±5.24)%]，miR-9-mimic+WT組相對熒光素酶活性[(28.43±3.15)%]明顯降低(P<0.001)；而相對于miR-NC+MUT組[(102.34±6.17)%]，miR-9-mimic+MUT組相對熒光素酶活性[(103.79±7.23)%]無明顯變化(P>0.05)。提示：TET2是miR-9的潛在的靶基因。

A：Western blot檢測BEAS-2B、A549和NCI-H1229細(xì)胞中TET2的相對表達(dá)水平；B：TargetScan篩選結(jié)果和雙熒光素酶檢測結(jié)果。***P<0.001與BEAS-2B細(xì)胞或miR-NC+WT組比較,n=3。

2.4 miR-9通過TET2影響A549細(xì)胞侵襲和遷移能力

將si-TET2轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor的A549細(xì)胞中，通過Transwell法檢測細(xì)胞侵襲及遷移，結(jié)果(圖4)顯示：與轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor+si-NC細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)[(78±6)個(gè)]和侵襲細(xì)胞數(shù)[(61±12)個(gè)]比較，轉(zhuǎn)染miR-9-inhibitor+si-TET2的A549細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)[(156±11)個(gè)]和侵襲細(xì)胞數(shù)[(121±8)個(gè)]均明顯增加(P<0.01)。

A：A549細(xì)胞侵襲與遷移的代表性Transwell圖；B：細(xì)胞遷移與侵襲的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。***P<0.001與miR-NC+si-NC組比較，##P<0.01與miR-9-inhibitor+si-NC組比較，n=4。

3 討論

目前NSCLC傳統(tǒng)化療方案因存在耐藥和無法徹底殺死腫瘤干細(xì)胞，從而導(dǎo)致NSCLC的高復(fù)發(fā)率[9]。了解NSCLC的進(jìn)展機(jī)制有助于NSCLC的治療。

miRNA在NSCLC的發(fā)病過程中具有重要作用[10]。miR-9被報(bào)道在膠質(zhì)瘤、喉癌和乳腺癌中表達(dá)升高[6-8]，而在胃癌和宮頸癌中顯著下調(diào)[11-12]，這體現(xiàn)了miR-9在不同的腫瘤中表達(dá)的特異性。然而，miR-9在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)及作用機(jī)制并不明確。本研究檢測NSCLC患者癌組織中miR-9的表達(dá)，結(jié)果顯示，在NSCLC組織中miR-9表達(dá)明顯升高，且隨著臨床分期遞增。另外，本研究在A549和NCI-H1229細(xì)胞同樣發(fā)現(xiàn)了miR-9高表達(dá)。這些結(jié)果提示miR-9可能在NSCLC的進(jìn)展中發(fā)揮作用。為驗(yàn)證miR-9在NSCLC細(xì)胞中的作用，本研究將miR-9-inhibitor轉(zhuǎn)染至A549和NCI-H1299細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)敲減miR-9可顯著降低NSCLC細(xì)胞增殖能力、侵襲和遷移。這些結(jié)果證明了敲減miR-9可抑制NSCLC的發(fā)展。

miRNA可通過靶基因發(fā)揮其生物學(xué)作用[3]。本研究通過靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)TET2是miR-9潛在的靶基因。TET2是生物體內(nèi)一種α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶，是DNA去甲基化過程中的一種重要的酶，在腫瘤中發(fā)揮重要作用[13]。TET2在NSCLC中發(fā)揮抑癌因子的作用[14-15]。本研究顯示，TET2在A549和NCI-H1299細(xì)胞中表達(dá)異常降低，且TET2是miR-9的靶基因。為進(jìn)一步研究TET2在miR-9調(diào)節(jié)NSCLC遷移與侵襲中的作用，本研究抑制A549細(xì)胞中miR-9的表達(dá)并同時(shí)干擾了TET2水平，結(jié)果顯示，干擾TET2表達(dá)可抑制miR-9敲減對A549細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用。以上結(jié)果提示，敲減miR-9通過TET2發(fā)揮抑制NSCLC細(xì)胞遷移與侵襲。

綜上，本研究證明了miR-9在NSCLC組織及NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，而敲減miR-9通過作用于TET2抑制NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究為NSCLC的治療提高了新的靶點(diǎn)。