miR-885-3p抑制胃癌細胞的增殖和遷移

李亞洲，韓瑞旸，衛(wèi)飛鵬

(1.寶雞高新人民醫(yī)院介入疼痛科，陜西 寶雞 721000； 2.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院肝膽與血管外科，陜西 西安 710065； 3.中國空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院介入放射科，陜西 西安 710038)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，在我國胃癌發(fā)病率位于所有惡性腫瘤第2位，死亡率位于第3位，其主要治療方式為手術治療；但是晚期胃癌仍然缺乏有效的治療方式，即使積極采取各種治療方式，其五年生存率仍然低于30%[1-2]。由于胃癌細胞生長、增殖快且易轉(zhuǎn)移，嚴重影響患者生命健康[3]。因此找到阻斷胃癌進展的分子靶點，對挽救患者生命具有極大的意義。

近年來，microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的治療提供新的解決途徑和思路。miRNA是一類內(nèi)生的、長度約為20～24個核苷酸的小RNA，由發(fā)夾結(jié)構的雙鏈RNA前體剪切而形成，在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA可以和靶基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)互相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后對目的基因的翻譯產(chǎn)生影響，調(diào)控目的基因表達，對不同的分子信號通路進行調(diào)控，進而影響細胞增殖、分化、凋亡、炎癥和應激反應，單個miRNA可對數(shù)個目的基因產(chǎn)生作用，而數(shù)個miRNA也可以作用于相同的目的基因，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡[4-5]。miRNA還能作為腫瘤抑制因子或致癌基因影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]。

miRNA-885-3p是由miRNA-885的3′端剪接而成的。有研究[8]表明：miRNA-885-3p的表達程度可能與肺癌耐藥性、膠質(zhì)瘤進展等有關，但是miRNA-885-3p對于胃癌增殖和遷移影響未見報道。因此，本研究通過比較miRNA-885-3p在胃癌細胞及正常細胞的表達，探討miRNA-885-3p對胃癌細胞增殖和遷移的影響。

1 試劑與方法

1.1 試劑及儀器

人胃癌細胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS以及人胃正常黏膜細胞GES-1均購自中國生物化學與細胞生物學研究所。Lipofectamine TM 2000以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，批號：1708113、A180302)，PCR引物序列由浙江格魯斯特生物科技公司合成。青霉素和鏈霉素(伊力特公司，批號：1805161、1809012)，基礎培養(yǎng)基和胎牛血清(Biological Industries公司)，酶標儀(Invitrogen公司)，CCK-8細胞計數(shù)檢測試劑盒(CST公司)，Trizol試劑(TaKaRa 公司)，Transwell小室 (Corning 公司)，Matrigel基質(zhì)膠(BD 公司，批號：356234)，CCK-8 試劑(同仁公司，批號：180109)，CO2細胞培養(yǎng)箱、熒光定量PCR儀(Thermo公司)，倒置顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)，IDTE 緩沖液(Integrated DNA Technologies公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將人胃癌細胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS以及人胃黏膜細胞GES-1細胞株，置于添加青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 mg·mL-1的含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，并在5%CO2、37 ℃、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。

選取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞胰酶消化后，用基礎培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×106個·mL-1，將細胞接種到6孔板后37 ℃孵育24 h，按照制造商說明書分別使用Lipofectamine TM 2000將mimic或miRNA-NC轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞，分為miR-mimic組和miR-NC組，檢測轉(zhuǎn)染效率，并將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞株作為空白對照組。

1.3 qRT-PCR檢測miRNA-885-3p表達

使用qRT-PCR分別檢測SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS、GES-1細胞miRNA-885-3p表達；并檢測miR-mimic組、miR-NC組及空白對照組miRNA-885-3p表達。miRNA-885-3p及U6的逆轉(zhuǎn)錄引物按文獻[7-8]報道設計，由浙江格魯斯特生物科技公司合成。

選擇狀態(tài)良好的細胞，當細胞生長密度達到80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗2～3次后將1 mL Trizol試劑加入到每個孔中，室溫條件下裂解5 min。將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，每管加入200 μL氯仿(4 ℃預冷30 min)，劇烈振蕩15 s混勻，室溫下靜置10～15 min。將混合液在4 ℃、2000 r·min-1離心15 min，液體明顯分層，將上層水相轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入等體積的異丙醇(4 ℃預冷30 min)，-20 ℃靜置30 min。將混合液置于4 ℃、2000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入適量75%乙醇(4 ℃預冷，DEPC水配制)重懸RNA沉淀。4 ℃、7500 r·min-1將重懸液離心5 min，棄上清晾干，以20 μL滅菌RNase-free水溶解，并適當吹打均勻。紫外分光光度法檢測RNA濃度和純度。

qPCR反應體系：25 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，20 ng cDNA和上下游引物(表1)共40 μmol·L-1，ddH2O補充至50 μL。TaKaRa試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用IDTE 緩沖液(pH=8.0)稀釋至10 ng·L-1。依據(jù)qRT-PCR說明書進行檢測，反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃ 45 s； 70 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。相應miRNA表達量檢測以參考基因(U6)進行歸一化處理。實驗重復6次。結(jié)果以2-△△Ct方法計算[9]。

表1 qRT-PCR檢測miRNA-885-3p的序列

1.4 細胞增殖能力檢測

采用CCK-8檢測各組不同時間點細胞活力，細胞轉(zhuǎn)染后48 h，將miR-mimic組、miR-NC組及空白對照組細胞分別消化，以每孔3000個細胞種于96孔板內(nèi)，每個分組設立5個復孔。分別在24、48、72、96 h進行CCK-8測量。測量時每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑混合液，并增加空白對照孔，放入細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，在避光條件下，酶標儀檢測450 nm波長處的光密度值，并記錄分析。以上實驗重復6次。

1.5 細胞遷移能力檢測

采用傷口愈合實驗檢測各組遷移能力，6孔板中接種miR-mimic組、miR-NC組，空白對照組細胞株，細胞密度調(diào)整為5×105個·孔-1，細胞單層鋪滿后用PBS液沖洗1次，然后用10 μL槍頭尖端在6孔板細胞上垂直劃痕，PBS液沖洗2～3次，之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用顯微鏡觀察0 h和24 h的細胞劃痕寬度并拍照。實驗重復6次。

1.6 細胞侵襲能力檢測

各組侵襲能力采用Transwell實驗檢測。將凍存的基質(zhì)膠提前融化，然后以1：8 的比例將其與不含血清的Matrigel基質(zhì)膠混勻，每個小室加入100 μL 混合液，放入37 ℃孵箱內(nèi)孵育24 h。3組細胞消化離心，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3×108個·L-1。Transwell小室上室加入200 μL細胞懸液，下室加入700 μL含血清的完全培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室后用PBS輕輕洗滌，棉簽擦去邊緣和內(nèi)側(cè)細胞。之后用4%多聚甲醛固定并晾干，加入0.1%結(jié)晶紫染色，固定時間20 min，染色時間15 min，PBS清洗掉染色液后自然風干，顯微鏡下拍照。實驗重復6次。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA-885-3p在胃癌細胞中低表達

SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS胃癌細胞株中miRNA-885-3p表達分別為(0.21±0.03)(0.46±0.06)(0.38±0.04)(0.42±0.05)，均顯著低于GES-1細胞的(1.24±0.33)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

*P<0.05與GES-1比較。圖1 胃癌細胞和正常胃黏膜細胞miRNA-885-3p表達水平比較

2.2 miRNA-885-3p過表達抑制胃癌細胞增殖

miR-mimic組、miR-NC組、空白對照組SGC-7901細胞miRNA-885-3p表達水平分別為(7.27±1.22)(1.02±0.05)(1.05±0.07)，miR-mimic組miRNA-885-3p表達水平顯著高于miR-NC組、空白對照組(P<0.05)，見圖2。CCK-8檢測結(jié)果顯示，miR-mimic組SGC-7901細胞活力顯著低于空白對照組和miR-NC組(P<0.05)，見圖3。

2.3 miRNA-885-3p過表達抑制胃癌細胞遷移

miR-mimic組、miR-NC組、空白對照組SGC-7901細胞遷移距離分別為(0.27±0.04)(0.52±0.06)(0.51±0.05)，miR-mimic組SGC-7901細胞遷移距離顯著低于miR-NC組、空白對照組(P<0.05)，見圖4—5。

2.4 miRNA-885-3p過表達抑制胃癌細胞侵襲

miR-mimic組、miR-NC組、空白對照組SGC-7901侵襲細胞數(shù)分別為(115±15)(212±27)(203±25)，miR-mimic組SGC-7901侵襲細胞數(shù)顯著低于miR-NC組、空白對照組(P<0.05)，見圖6—7。

*P<0.05與miR-mimic組比較。圖6 3組SGC-7901侵襲細胞數(shù)比較

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，是我國癌癥死亡的主要原因之一，其致病分子機制非常復雜且相關研究較少[10-11]。胃癌晚期患者通常采取癌癥組織的擴大根治性切除，同時輔助化療或放化療。據(jù)文獻[12]報道：晚期胃癌患者具有高復發(fā)率、低生存率的特點。因此，探索胃癌增殖、轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找特異性標志物或建立準確、低危害的治療策略，已成為臨床胃癌研究重點。

非編碼RNA(ncRNAs)，包括miRNAs和long ncRNAs(lncRNAs)，約占基因組的98%，已被發(fā)現(xiàn)在生理和病理條件下參與蛋白編碼基因的調(diào)控[13-14]。miRNAs通過調(diào)控多種信號通路，在細胞生長和凋亡、細胞分化、胰島素分泌、胚胎后期發(fā)育等諸多重要的生理過程中發(fā)揮調(diào)控作用[15]。其中，惡性腫瘤的發(fā)生可能與miRNA的異常表達相關，miRNA表達異常引起目的基因表達水平上調(diào)或下調(diào)，進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生和進展，涉及的可能機制包括對細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、細胞內(nèi)酶、藥物轉(zhuǎn)運等的異常調(diào)控。近年，miR-885-3p被報道參與了多種癌癥的發(fā)病機制，但是其作用在不同的腫瘤并不一致[16-18]。miR-885-3p在肉瘤細胞中，通常呈過表達，但其具體分子機制尚未明確；在涉及γ-突觸蛋白的癌癥中已經(jīng)證明上調(diào)mir-885-3p可導致其發(fā)生[19]。與此相反，miR-885-3p在結(jié)腸癌中可通過靶向BMPR1A和阻斷BMP/Smad/Id1信號通路來阻斷血管生成，在乳腺癌中通過靶向免疫調(diào)節(jié)蛋白B7-H337來發(fā)揮抑癌作用[20-21]。但是miRNA-885-3p與胃癌的調(diào)控網(wǎng)絡關系及其在癌變發(fā)展過程中的作用仍未涉及。因此，本研究通過比較研究miRNA-885-3p在胃癌細胞及正常細胞的表達，為胃癌發(fā)病機制研究提供新的靶點。

本研究qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較正常人胃黏膜細胞，miRNA-885-3p在SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS胃癌細胞中呈低表達。而在miR-mimic組的細胞中miRNA-885-3p呈高表達。傷口愈合實驗、transwell實驗、CCK-8檢測各組細胞增殖、遷移能力，發(fā)現(xiàn)miR-mimic組細胞增殖、遷移能力均顯著低于空白對照組和miR-NC組。這提示miRNA-885-3p可能是胃癌的抑制基因，可能成為胃癌潛在的治療靶點。miRNA-885-3p過表達，可能抑制胃癌細胞增殖、遷移。這可能與周期蛋白依賴性激酶-4(CDK4)有關，CDK4在各腫瘤細胞中均有上調(diào)，主要集中在細胞生長，可促進腫瘤發(fā)生、進展、遷移[22-23]。如在乳腺癌中miR-885-3p表達水平的增加可降低CDK4的表達，進而起到抑癌作用[24]。近年來研究[25-26]發(fā)現(xiàn)：miRNA或lncRNA均能通過CDK通路調(diào)控乳腺癌、卵巢癌進展，通?？蓪е录毎鲋逞舆t、細胞周期G1/S期阻滯或細胞凋亡增強。但是本研究仍然存在一定的局限性，如在胃癌細胞中，miRNA-885-3p過表達影響胃癌進展的具體機制，需要進一步的研究闡述。